[发明专利]一种水稻耐盐基因OsRR22引导引物、应用和靶点载体及靶点载体制备方法

说明书

本发明涉及一种水稻耐盐基因OsRR22引导引物、应用和靶点载体及靶点载体制备方法。所述的水稻耐盐基因OsRR22引导RNA靶点序列引物分别为RR22‑gRT+和RR22‑OsU6aT‑。该靶点序列引物可以应用于编辑水稻基因组，具有方便、高效等特点。利用本发明提供的水稻耐盐基因OsRR22引导RNA靶点序列引物编辑水稻基因组，水稻耐盐基因OsRR22突变效率为90%以上，其中25%是纯合突变体。为快速创建水稻耐盐种质提供了重要参考，为水稻种质创新提供了新途径。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种水稻耐盐基因OsRR22引导引物、应用和靶点载体及靶点载体制备方法。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，是全球三分之一人口的主要口粮。水稻产量是否供给充足直接影响全球粮食安全。

而盐碱胁迫是制约水稻生产的主要非生物胁迫因素之一。一方面，还有较大面积的盐碱地无法种植水稻，另一方面，我们面临的环境日益恶化，土地盐碱化逐年加剧，提高水稻耐盐性已成为育种家的重要目标之一。截至目前，已经克隆的耐盐相关的基因有：SKC1，DST，OsRR22，HAL2，P5CS，CMO，BADH，mtlD，gutD和SAMDC等。其中，OsRR22是一个负调控基因，编码一个696个氨基酸的B型反应调节蛋白转录因子，参与细胞分裂素信号转导和代谢，它的功能缺失显著提高了耐盐性。

CRISPR/Cas是一种在细菌和古细菌中发现的获得性免疫防御系统，目前已发现的CRISPR/Cas系统包括I、II和III型，其中II型系统的组成较简单，由其改造成的CRISPR/Cas9技术以其易操作、低成本、高效率、高特异性和多重基因编辑等优势迅速成为了植物基因组精确编辑最为有效的工具，广泛地应用于动物、植物、微生物等基因功能和遗传改良研究。利用CRISPR/Cas9技术定点敲除不利基因或者负调控基因，快速敲除控制不良性状的基因簇从而实现目标性状的精准改良，将会大大提高作物定向遗传改良效率。目前CRISPR/Cas9技术在水稻上也有很多成功的案例，但是，鲜有对水稻优良亲本进行重要育种价值的抗性、产量等基因编辑改良的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种用于创建水稻耐盐基因OsRR22缺失突变体的引导RNA靶点序列引物，以及提出一种含有该引物序列的靶点CRISPR/Cas9-sgRNA及其制备方法。

本发明为解决上述技术问题提出的技术方案(一)是：一种水稻耐盐基因OsRR22引导RNA靶点序列引物，其核苷酸序列为：

RR22-gRT+：5’AGAGGGATCAATTCCCCGTgttttagagctagaaat-3’

RR22-OsU6aT-：5’-ACGGGGAATTGATCCCTCTCggcagccaagccagca-3’。

本发明为解决上述技术问题提出的技术方案(二)是：水稻耐盐基因OsRR22引导RNA靶点序列引物的用途是：在编辑水稻基因组中的应用。

进一步的，所述的应用包括利用PCR扩增的方法构建权利要求1所述的引导RNA靶点序列的sgRNA表达盒；

将sgRNA表达盒装载到CRISPR/Cas9载体上，得到含靶点序列的CRISPR/Cas9-sgRNA载体；

将靶点CRISPR/Cas9-sgRNA载体转化水稻愈伤组织，得到水稻耐盐基因OsRR22突变体。

本发明为解决上述技术问题提出的技术方案(三)是：一种靶点CRISPR/Cas9-sgRNA，含有上述的水稻耐盐基因OsRR22引导RNA靶点序列片段。

本发明为解决上述技术问题提出的技术方案(四)是：上述靶点CRISPR/Cas9-sgRNA载体的制备方法，包含以下步骤：