[发明专利]重组安克洛酶及工业规模制备和纯化方法及其组合物有效
申请号: | 201910286716.5 | 申请日: | 2019-04-10 |
公开(公告)号: | CN110016471B | 公开(公告)日: | 2020-10-02 |
发明(设计)人: | 孙雷;王增博 | 申请(专利权)人: | 北京博康宁生物医药科技有限公司 |
主分类号: | C12N9/64 | 分类号: | C12N9/64;A61K38/48;A61K9/08;A61K9/00;A61K47/02;A61P9/10 |
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地址: | 102600 北京市大兴区生物*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 重组 安克洛酶 工业 规模 制备 纯化 方法 及其 组合 | ||
1.纯化重组安克洛酶的方法,其包括在将得到的重组安克洛酶蛋白用反相液相色谱纯化后,采用如下方式进行Heparin Sepharose 6 Fast Flow凝胶亲和柱层析纯化:
层析柱,填料为Heparin Sepharose 6 Fast Flow,样品为重组安克洛酶蛋白用反相液相色谱纯化后的活性主峰,用PBS-LYS缓冲液稀释至1000ml,上样,柱流速为2mL/min;上样后,用PBS-LYS缓冲液平衡至基线,用PBS-LYS缓冲液洗脱,收集活性组分;用PBS-LYS缓冲液洗脱杂质组分,再用PBS-LYS缓冲液冲洗层析柱1000ml,再生,备用,得到重组安克洛酶原液;
所述PBS-LYS缓冲液包含:0.2%氯化钠、0.1%盐酸L-赖氨酸、15mmol/L磷酸二氢钠并加氢氧化钠调节pH6.8、水适量至全量。
2.根据权利要求1的方法,所述层析柱的柱直径50mm,长度12cm。
3.对重组安克洛酶进行纯化的方法,该方法包括如下步骤:
(41)上层析柱前预处理:将含有重组安克洛酶的培养液进行过滤去除细胞碎片,收集滤液,接着进行超滤浓缩,截留分子量30KDa膜板超滤至原体积的1/8~1/10;
(42)亲和层析柱:采用亲和层析柱进行纯化,使用盐浓度0.1~0.4mol/L的NaCl、0.05mol/L的Tris-HCl pH7.0~7.5缓冲液的洗脱条件,洗脱并收集活性组分;
(43)反相液相色谱纯化:采用制备型反相液相色谱技术,纯化上述得到的重组安克洛酶蛋白,利用极性大小的差别,采用乙醇-水系统梯度洗脱的方法,进一步去除其他杂质;
(44)亲和柱层析:将上一步骤收集的重组蛋白采用亲和层析柱纯化,去除乙醇并实现重组蛋白的浓缩,
其中,步骤(44)的操作如下:
层析柱,填料为Heparin Sepharose 6 Fast Flow,样品为步骤(43)中的活性主峰,用PBS-LYS缓冲液稀释至1000ml,上样,柱流速为2mL/min;上样后,用PBS-LYS缓冲液平衡至基线,用PBS-LYS缓冲液洗脱,收集活性组分;用PBS-LYS缓冲液洗脱杂质组分,再用PBS-LYS缓冲液冲洗层析柱1000ml,再生,备用,得到重组安克洛酶原液;所述PBS-LYS缓冲液包含:0.2%氯化钠、0.1%盐酸L-赖氨酸、15mmol/L磷酸二氢钠并加氢氧化钠调节pH6.8、水适量至全量。
4.根据权利要求3的方法,所述层析柱的柱直径50mm,长度12cm。
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