[发明专利]用于双重PCR检测猪Foxp3、IL-10基因的引物、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于双重PCR检测猪Foxp3、IL‑10基因的引物、试剂盒及其应用。用于双重PCR检测猪Foxp3、IL‑10基因的引物组，由核苷酸序列如SEQ ID NO.1，2，5和6所示的引物组成。用于猪Foxp3、IL‑10基因的TaqMan实时荧光定量PCR检测的试剂，包含所述引物组以及核苷酸序列如SEQ ID NO.7和8所示的荧光探针。本发明的试剂和方法具有检测快速、敏感性高、特异性好、检测结果稳定可靠的优点，可实现对大规模样品的快速定量检测，对于评价猪体的免疫应答水平和免疫稳态具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及用于免疫调控分子猪Fxop3和IL-10的双重PCR检测的引物、试剂盒及其应用。

背景技术

调节性T淋巴细胞(Regulatory T Cell,Treg)是体内针对自身和外来抗原下调抗原特异性T淋巴细胞应答、抑制免疫病理损伤的CD4+T淋巴细胞亚群，在免疫应答调控和维持机体免疫稳态中发挥重要作用。Treg细胞根据活化方式和膜标志分子不同，分为nTreg(天然性Treg,natural Regulatory T Cell)和iTreg(诱导性Treg,induced Regulatory TCell)，其中，nTreg在胸腺内分化、发育和成熟，在外周血中占CD4+T细胞总数的5-10％，nTreg限制免疫效应应答的强度，维持机体对感染的适度性应答，nTreg数量的变化直接反映机体的免疫状态和感染的进展，是临床免疫功能监测的重要指标。

Foxp3(forkhead box P3 protein，Foxp3)是叉头状转录因子成员，特异性表达于Treg细胞表面，在Treg发育和功能上是必须的，Foxp3的高表达通过多种机制赋予Treg细胞的免疫抑制功能。

白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)，可由T细胞、巨噬细胞、DC细胞和B细胞等多种免疫细胞分泌，是Treg发挥免疫负调控的重要细胞因子，可同时介导Th1和Th2的免疫应答负反馈调控。

现有的检测Foxp3和IL-10的方法主要集中在人类和小鼠上，对猪的相关因子检测还没有成熟的试剂盒产品，因此开发能同时、一步法检测猪Foxp3和IL-10的定量检测试剂盒，实时检测因子动态变化，能对猪体内的免疫状态评价和疫苗推广使用提供良好的数据支撑。

发明内容

为满足上述领域的需求，本发明提供用于双重PCR检测猪Treg标志分子Foxp3和功能因子IL-10的引物组、试剂、试剂盒及其应用，可实现对Foxp3、IL-10的同步、快速、定量检测。

本发明的一个目的是提供用于双重PCR检测猪Foxp3、IL-10基因的引物组，其特征在于，包含如下引物：

Foxp3–F：5′-GGCATCATCTGACAAGGGTT-3′；

Foxp3-R：5′-TTGTGAAAGAAATCTGGGAA-3′；

IL-10-F：5′-GCGACTTGTTGCTGACCG-3′；

IL-10-R：5′-CCATCACTCTCTGCCTTC-3′。

本发明的另一个目的是提供用于猪Foxp3、IL-10基因TaqMan实时荧光定量双重PCR检测的试剂，其特征在于，包含所述引物组，以及如下荧光探针：

Foxp3-荧光探针：核苷酸序列为5′-GTATTGTAGCCACTGGCACC-3′，其5′末端连接第一荧光基团，3′连接第一淬灭基团；

IL-10-荧光探针：核苷酸序列为5′-CTGCTGGAGGACTTTAAGG-3′，其5′末端连接第二荧光基团，3′连接第二淬灭基团；

所述第一荧光基团与所述第二荧光基团发射的荧光信号不同。