[发明专利]一种防治丙型病毒性肝炎的新靶点及其CRISPR-Cas9靶向系统与应用

说明书

本发明公开了一种防治丙型病毒性肝炎的新靶点及其CRISPR‑Cas9靶向系统与应用。本发明研究发现一种新的丙型病毒性肝炎防治靶点，即miR‑615‑3p，该基因与ApoB和ApoE具有正向调节关系，敲除miR‑615‑3p后可抑制ApoB和ApoE基因的表达，从而防治丙型病毒性肝炎。同时本发明还构建了一种特异性靶向miR‑615‑3p基因的CRISPR‑Cas9系统，利用该系统可以高效特异性敲除miR‑615‑3p基因，靶向性提高、操作技术简单，在丙型病毒性肝炎防治方面具有很好的应用前景，同时，本发明的成果有助于进一步揭示丙型病毒性肝炎的防治的分子机制，在新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种防治丙型病毒性肝炎的新靶点及其CRISPR-Cas9靶向系统与应用。

背景技术

丙型病毒性肝炎是一种由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染引起的病毒性肝炎，可通过母婴、输血、性接触等传播。全世界约有1.8亿人感染了HCV，导致肝纤维化和肝硬化，严重时会发展成肝癌，已成为全球重要的公共卫生问题之一。

早期治疗HCV主要通过聚乙二醇干扰素联合利巴韦林，但副作用较大，治疗周期较长，且对不同基因型疗效不同。近几年直接抗病毒药物(Direct antiviralagents，DAA)得到长足发展，其主要是针对HCV生命周期中特定病毒蛋白的靶向药物，能有效提高患者的持续病毒应答率(SVR)。但是，这种治疗方案同样会产生药物副作用，并且治疗过程中伴有耐药突变、费用高昂的缺陷。此外，HCV暂无在病毒侵入前的预防性药物或治疗手段，晚期丙肝患者在进行肝移植手术后的再次感染率非常高。

另外，现有的技术中，CN103215269A公布了一种利用靶向干扰磷脂酰肌醇4-激酶(PI4K)基因双链核糖核酸(dsRNA)用于治疗HCV病毒感染；CN10135095A公布了一种靶向HCV的内部核糖体进入位点(IRES)序列的短发夹核糖核酸(shRNA)和双链小干扰核糖核酸(siRNA)构件用于抑制HCV的表达或活性。CN102257140A公布了通过miRNA-196降低Bach1表达，同时上调HMOX1表达，进而治疗患有HCV感染的哺乳动物。以上结果表明，通过基因干扰可以实现治疗丙型病毒性肝炎。

在基因干扰技术方面，CRISPR(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)是一种来自细菌抵御入侵的病毒或其它外源DNA的免疫机制。其中CRISPR/Cas9系统是应用最为广泛的基因编辑技术，它利用可与基因序列配对的单链sgRNA引导Cas9核酸酶靶向并切割特定基因组位点，形成的双链DNA断裂激发内源性DNA修复机制引入基因突变。CRISPR与内源性同源重组(Homologous recombination,HR)结合可实现简单高效的精确遗传操作。从2013年问世以来已被应用到药物筛选、癌症治疗、农作物和家畜育种等多个领域。与ZFN和siRNA相比，CRISPR-Cas9具有快速、高效、特异性靶向敲除基因的优势。

因此，不断寻求新的靶点以及基因干扰手段是本领域的研究热点。

发明内容

本发明的第一个目的是研究筛选获得了一种新的丙型病毒性肝炎防治靶点，即miR-615-3p(基因前体序列如SEQ ID NO.1所示)。本发明研究发现，miR-615-3p与ApoB和ApoE具有正向调节关系，敲除miR-615-3p后可抑制ApoB和ApoE基因的表达，从而防治丙型病毒性肝炎。

本发明另一目的是提供一种靶向敲除miR-615-3p基因的CRISPR-Cas9系统，利用该系统可以实现高效特异性敲除miR-615-3p基因的目的。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

基于上述本发明的研究，以下应用均应在本发明的保护范围之内：