[发明专利]含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株和嵌合减毒株拯救方法

说明书

本发明公开了一种含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株和嵌合减毒株拯救方法，先对H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA序列进行碱性裂解位点改造，使其由高致病性病毒变为低致病性病毒，然后合成H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因，以合成的HA基因和构建好的pBD‑Ya1688‑HA转染质粒为模板，设计并合成构建A/B型嵌合HA质粒的扩增引物，其次采用无缝克隆方法将H5亚型流感病毒的HA基因定向克隆到pBD‑Ya1688‑HA转染质粒中，形成A/B型嵌合HA质粒，最后利用A/B型嵌合HA质粒拯救含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株和嵌合减毒株。解决了流感减毒疫苗容易引起毒力返祖的问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种含有表达H5亚型2.3.4.4谱系流感病毒HA蛋白的A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株和嵌合减毒株拯救方法。

背景技术

目前临床上主要有灭活疫苗和冷适应减毒疫苗。灭活疫苗只能引起体液免疫，每年需要定期免疫；冷适应减毒疫苗可引起粘膜免疫，免疫效果好，但是安全性不如灭活疫苗，因为是活的病毒，有毒力返祖的风险。

灭活疫苗与减毒活疫苗诱导不同的免疫反应：灭活疫苗一般通过肌肉注射的方式给药，主要引起体液免疫；减毒活疫苗可以通过滴鼻的方式接种，模拟流感病毒的自然感染，引起更持久，更广泛的体液免疫和细胞免疫，在此基础上减毒活疫苗还可引起粘膜免疫。减毒活疫苗在用量较少的情况下具有比灭活疫苗更加良好的免疫效果，而且减毒活疫苗的制造不需要纯化HA蛋白，更加节省时间和成本，但是在安全性和耐受性方面减毒活疫苗不如灭活疫苗。减毒活疫苗使用受限的一个非常重要的原因是疫苗株存在与流感流行株基因重配的风险。H5亚型流感减毒活疫苗的制备需要考虑疫苗毒株与自然界流行的A型流感病毒发生型间重配的问题，疫苗株与流行株的错配不仅可以导致疫苗效力的降低，还容易产生出毒力未知的新病毒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株和嵌合减毒株拯救方法，以解决目前减毒活疫苗因疫苗株容易引起毒力返祖的问题。

本发明所采用的技术方案是，含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株拯救方法，具体步骤如下：

步骤S1、合成H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因；

步骤S2、构建A/B型嵌合HA质粒：以合成的H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因和构建好的B型流感病毒B/Yamagata/16/88 8质粒反向遗传操作系统中的pBD-Ya1688-HA转染质粒为模板，设计并合成构建A/B型嵌合HA质粒的扩增引物，最后采用无缝克隆方法将H5亚型流感病毒的HA基因定向克隆到pBD-Ya1688-HA转染质粒中，形成A/B型嵌合HA质粒；

步骤S3、采用A/B型嵌合HA质粒拯救含有A/B型嵌合HA质粒的嵌合病毒株。

进一步的，所述步骤S1中合成H5亚型流感2.3.4.4谱系的HA基因前需要对H5亚型流感2.3.4.4谱系A/cat/Sichuan/SC18/2014的HA序列进行碱性裂解位点改造，使其由高致病性病毒变为低致病性病毒。

进一步的，所述碱性裂解位点改造是去除碱性裂解位点附近的三个碱性氨基酸，并改变其附近三个氨基酸密码子，具体是去除H5亚型流感2.3.4.4谱系A/cat/Sichuan/SC18/2014的HA序列第342位到第344位的三个碱性氨基酸，同时改变第339位、第341位和第345位的氨基酸的密码子进行。