[发明专利]一种大片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼

说明书

一种大片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼，其获得方法包括如下步骤，CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计；构建表达载体以及体外合成；斑马鱼胚胎的显微注射；T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性；注射两个月之后，进行剪尾鉴定；目的序列的TA克隆；质粒的Sanger测序；获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代；获得斑马鱼突变体的F2代纯合子；依据步骤九方法进行stat1a基因缺失型斑马鱼的F3代纯系遗传，得到stat1a‑17的斑马鱼纯合品系；筛选stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼。

技术领域

本发明涉及CRISPR/Cas9基因打靶领域，特别涉及一种大片段 stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼。

背景技术

STAT1(signal transducer and activator of transcription 1)基因位于人类2q32.3，是编码750个氨基酸的转录因子。一般认为该基因介导干扰素信号通路，可直接调控靶基因的转录，并参与细胞增殖与分化等过程。通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析发现STAT1基因与骨质疏松密切相关。

斑马鱼与人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且STAT1基因进化上较为保守，人类STAT1基因的两个不同剪接体STAT1-alpha和STAT1-beta对应于斑马鱼两个不同基因stat1a 和stat1b，研究发现stat1b和stat1b在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼个体小、幼鱼通体透明，利于骨骼发育的观察。

通过CRISPR/Cas9基因打靶技术，分别在斑马鱼stat1a和stat1b 基因上设计合适的打靶位点，将体外合成的特异性sgRNA(终浓度 20ng/μL)和Cas9-mRNA(终浓度300ng/μL)显微共注射进斑马鱼一细胞内，并通过活性检测证实了所选位点的有效性。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种大片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种大片段stat1a/stat1b基因双突变缺失型斑马鱼，其获得方法包括如下步骤，步骤一、CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计；

在NCBI上查询斑马鱼stat1a基因的基因组DNA序列及其功能结构域,根据CRISPR/Cas9敲除原理，设计一对stat1a基因的靶位点，

步骤二、构建表达载体以及体外合成；

步骤三、斑马鱼胚胎的显微注射；

在受精成功30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中；在进行显微注射之前,将Cas9mRNA和 gRNA配成混合液,充分混匀,使Cas9mRNA的终浓度为300ng/μL， gRNA的终浓度为20ng/μL，注射1.8nLCas9mRNA和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内,注射过的受精卵置于5mmol/L NaCl、 0.33mmol/L CaCl2、0.33mmol/L MgSO4、0.17mmol/L KCl的E3水中,28℃孵化，在体视显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析；

步骤四、T7E1法和Sanger测序检测靶位点的有效性；

对斑马鱼胚胎进行显微注射之后,挑选部分发育正常的早期胚胎, 检测其stat1a基因是否存在突变；将纯化回收后的DNA进行T7核酸内切酶Ⅰ酶切；

步骤五、注射两个月之后，进行剪尾鉴定；

将斑马鱼单条成鱼进行剪尾，剪其尾鳍1/3到1/2，后加入裂解液400μL和蛋白酶K2μL，55℃水浴，进行裂解释放DNA，时间不要超过12小时；然后进行基因组提取，PCR后纯化回收；