[发明专利]一种Bt蛋白Cyt2-like及其基因和应用

说明书

本发明公开了一种Bt蛋白Cyt2‑like及其基因和应用。该蛋白具有较好的杀虫活性，将其用于制备转基因植物，能够特异性杀灭害虫，并降低农药的使用量，降低成本，减少环境污染。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Bt蛋白Cyt2-like及其编码基因和应用。

背景技术

在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素。据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽胞杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽胞形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystal proteins，简称ICPs)，ICPs主要由cry和cyt基因编码，具有特异的杀虫活性，Cyt类杀虫晶体蛋白发现了3类，分别是Cyt1类、Cyt2类和Cyt3类，Cyt类蛋白中，第一等级蛋白共3类，其中最多的一类为Cyt2类，共25个蛋白，Cyt类蛋白分子量一般在27-30kDa。Bt具有高效专一、无毒、不污染环境等特点，被广泛作为微生物杀虫剂应用在农林、果蔬以及卫生等害虫防治，近年来Bt杀虫晶体蛋白编码基因已大量应用在转基因玉米、棉花、大豆等农作物中，取得了良好的防治效果。

自1981年Schnepf从菌株HD-1中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了500多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类。最近研究表明，Cyt类蛋白可能成为控制害虫对Cyt类杀虫晶体蛋白产生抗性的一种新策略，因为它与广泛应用的Cry类蛋白相比,具有不同的蛋白结构和独特的作用机制。它除了具有杀虫特性以外,还具有在体外广泛溶细胞的能力。这些特性使它成为控制害虫对苏云金杆菌的Cry类毒素蛋白的抗性的一种最有潜力的毒蛋白。此外，Federici发现Cyt1Aa不但对棉花叶甲(Chrysomela scripa)有较高的毒性,而且可以抑制此叶甲对Cry3Aa的抗性达5000倍。

以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodiainterpunctella)在Dipel(Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题，但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现。

为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力Bt基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。

发明内容