[发明专利]一种制备肌氨酸氧化酶的基因工程菌及其制备方法和应用

说明书

本发明属于基因工程和蛋白表达工程领域，涉及一种生物工程技术高效制备肌氨酸氧化酶的方法，以CGMCC No.17306为出发菌株，经比对获得菌株CGMCC No.17306的肌氨酸氧化酶基因，通过基因合成获得目的基因，并构建表达载体SOX‑pET，将表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)，构建获得所述的产肌氨酸氧化酶的基因工程菌GLYH18。本发明还提供了所述产肌氨酸氧化酶的基因工程菌用于发酵生产肌氨酸氧化酶的应用。本发明操作简单，成本低，成品率高，且筛选出的肌氨酸氧化酶酶活高、热稳定性好，比起野生菌株，重组的基因工程菌更具备工业化生产能力。

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白表达工程领域，涉及一种生物工程技术高效制备肌氨酸氧化酶的方法，产物可用于生产肌氨酸检测试剂盒。

背景技术

肌氨酸又名N-甲基甘氨酸，是胆碱自然代谢为甘氨酸过程中的一个非编码氨基酸中间体，可以由氯乙酸与甲胺反应制得，也可以由甘氨酸通过N-甲基转移酶作用生成。肌氨酸有甜味，溶于水，存在于人体的肌肉及其他一些组织中，生理状态下正常人体血清中的肌氨酸含量是(1.59±1.08)nmol/L。

2009年，Sreekumar等发现肌氨酸可激活前列腺癌细胞，并且其在尿液中被检测到意味着恶性前列腺癌的发生。肌氨酸成为前列腺癌进展和转移时显著增加的一个代谢产物，能够在尿液中被检测到，因而被确定为前列腺癌的一个特异性指标。

目前用于检测肌氨酸的方法主要有液相色谱或气象色谱与质谱联用检测法、肌氨酸氧化酶荧光检测法、毛细管电泳电化学发光检测法、肌氨酸氧化酶分光光度检测法。而肌氨酸氧化酶分光光度法，检测成本低，可适用于目前任何一种全自动生化分析仪，可满足于临床大批量样品的检测需要。

肌氨酸氧化酶作为一种重要的诊断酶制剂，尽管目前许多国内外学者对其已有研究，但在实际生产中仍然存在产量低、热稳定性不好的问题，且国内研究较少，因此如何快速制备出酶活高、产量高适应工业化生产的肌氨酸氧化酶具有重要意义。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种产肌氨酸氧化酶的基因工程菌。

本发明的第二个目的在于，提供一种肌氨酸氧化酶的生产方法，通过发酵生产上述所述的产肌氨酸氧化酶的基因工程菌获得肌氨酸氧化酶。

本发明的第三个目的在于提供一种产肌氨酸氧化酶的基因工程菌用于发酵生产肌氨酸氧化酶的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种产肌氨酸氧化酶的基因工程菌，是将保藏号CGMCC No.17306的LYH18菌株的肌氨酸氧化酶基因进行克隆后，导入大肠杆菌BL21(DE3)构建获得。

一种产肌氨酸氧化酶的基因工程菌的构建方法；以CGMCC No.17306为出发菌株，经比对获得菌株CGMCC No.17306的肌氨酸氧化酶基因，通过基因合成获得基因，并构建表达载体SOX-pET，将表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)，构建获得所述的产肌氨酸氧化酶的基因工程菌。

进一步的，所述的构建方法包括如下步骤：

(1)获得目的序列：以芽孢杆菌CGMCC No.17306为出发菌株，与现有肌氨酸氧化酶基因比对得到原始肌氨酸氧化酶基因，改造并全基因合成微生物来源肌氨酸氧化酶编码基因序列，如SEQ No.1所示；

(2)克隆载体构建：将步骤(1)中经过改造后肌氨酸氧化酶基编码基因序列插入表达载体pET-28a(+)中，构建成表达载体，命名为载体SOX-pET。

(3)目的基因扩增：以SOX-pET为模板进行PCR扩增，PCR产物鉴定纯度和分子量的大小，PCR产物经DNA回收试剂盒回收。