[发明专利]Bna-miR393在调控甘蓝型油菜生殖器官发育过程中的应用

说明书

本发明涉及Bna‑miR393在调控甘蓝型油菜生殖器官发育过程中的应用。具体涉及分离、克隆和应用一种包含Bna‑miR393前体序列（pre‑miR393）的DNA片段，其序列如SEQ ID NO:1所示，序列长度为618 bp，其对应的成熟miRNA序列如SEQ ID NO:2所示。甘蓝型油菜遗传转化的功能分析表明Bna‑miR393参与调控甘蓝型油菜生殖器官的发育，这对于甘蓝型油菜遗传育种改良具有十分重要的意义。

技术领域

本发明涉及甘蓝型油菜基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够影响生殖器官发育的甘蓝型油菜Bna-miR393在甘蓝型油菜遗传育种改良中的应用。本发明采用RT-PCR的方法，分离到包含甘蓝型油菜Bna-miR393前体序列的DNA片段，过量表达Bna-miR393能够影响甘蓝型油菜生殖器官的发育，证实了该miRNA的功能及其应用途径。

背景技术

甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是我国主要的油菜栽培种类，具有高产、抗逆性强、适应性广等特点。miRNA是一类长度约为21-24 nt的内源非编码小RNA。植物miRNA是由DCL1剪切酶对初始转录物剪切加工而来，成熟的miRNA序列与RNA介导的沉默复合体结合，识别与miRNA序列互补的靶基因，最终通过对靶基因进行剪切或翻译抑制来实现对靶基因的调控。随着高通量测序技术的发展，大量研究发现miRNA参与植物生长发育的多个方面，包括种子萌发、叶片形态、花的分化与发育、根的发育、营养期到生殖期的转变等（D'ArioM, Griffiths-Jones S, Kim M. Small RNAs: big impact on plant development.Trends Plant Sci, 2017, 22(12): 1056-1068）；此外，miRNA在植物抗病以及抵御非生物胁迫等方面也具有重要作用。miR393是植物中较为保守的miRNA家族，其靶基因编码生长素受体蛋白TIR1、AFB1/2/3等，该类蛋白参与生长素信号感知和Aux/IAA蛋白降解，而Aux/IAA蛋白可以通过与ARF等互作抑制生长素相关基因表达，从而调控植物生长发育、以及对生物和非生物胁迫的应答（Parry G, Calderon-Villalobos LI, Prigge M, et al. Complexregulation of the TIR1/AFB family of auxin receptors. Proc Natl Acad Sci USA,2009, 106(52): 22540-22545）。研究表明，miR393在植物抗菌性过程中的关键性作用，拟南芥中过表达miR393可以提高植株对外源病菌细菌感染的抵抗能力（Navarro L, DunoyerP, Jay F, et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance byrepressing auxin signaling. Science, 2006, 312(5772): 436）。

利用转基因技术获得生殖器官形态表型完全不同的甘蓝型油菜目前尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供甘蓝型油菜Bna-miR393的序列及功能，并进一步公开该miRNA在调控甘蓝型油菜生殖器官发育中的应用。

本发明以甘蓝型油菜为研究材料，通过前期甘蓝型油菜的生殖器官不同发育时期RNA-seq比较分析，发现Bna-miR393在甘蓝型油菜的生殖器官发育过程中明显差异表达，说明该miRNA可能参与调控甘蓝型油菜生殖器官的发育。因此，从甘蓝型油菜中分离包含甘蓝型油菜Bna-miR393前体序列的DNA片段，并鉴定Bna-miR393在甘蓝型油菜生殖器官发育过程中所发挥的功能，对于甘蓝型油菜遗传育种改良将具有非常重要的意义。