[发明专利]一种新型人源脂肪干细胞制剂的制备方法

权利要求书

1.一种新型人源脂肪干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：人体脂肪组织采集：对供者进行体检，然后在局部麻醉的状态下，采用肿胀法吸脂术获取脂肪；

S2：制备原代脂肪干细胞：将步骤S1中得到的脂肪中置于0.2％-0.4％的混合胶原酶中，在37℃的温度下均匀震荡消化30-40分钟，随后向其中加入0.25％的Trypsin-EDTA消化液，在37℃的温度下均匀震荡消化10-15分钟后，加入胰蛋白酶抑制剂混合均匀终止消化；随后将其用900g的转速离心10分钟后，吸弃上层混合液，用PBS清洗底层细胞，并通过100目筛网过滤；将滤液用210g的转速离心10分钟，吸弃上清液，得到原代脂肪干细胞；

S3：原代脂肪干细胞培养：将步骤S2中得到的原代脂肪干细胞加入到无血清培养基重悬，进行细胞计数后，按大于3×104/cm2的密度接种到使用Laminin-521溶液包被的细胞培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养2天后，弃去培养液更换新鲜无血清培养基，将细胞培养瓶于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，每两天更换一次新鲜无血清培养基；当脂肪干细胞生长融合达到80％以上时，用Trypsin-EDTA消化液进行消化，按照1:3的比例进行传代，得到大量脂肪干细胞；

S4：检测及冻存：取步骤S3中得到的脂肪干细胞进行细胞计数和检测，判断其是够达到合格标准；经检测合格后，将步骤S3中得到的脂肪干细胞加入到细胞冻存液重悬，再分装到细胞冻存管，进行冻存保存。

2.根据权利要求1所述的新型人源脂肪干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，采用肿胀法吸脂术获取脂肪过程中，最大负压为430mmHg，获取的脂肪经过300-800μm过滤孔过滤出油脂和水分，得到呈淡黄色脂肪。

3.根据权利要求1所述的新型人源脂肪干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1和所述步骤S2之间还包括对采集得到的脂肪进行预处理，具体操作为：将步骤S1中得到的脂肪用PBS液进行多次清洗，直至清洗液为清澈透亮，脂肪呈现干净的淡黄色。

4.根据权利要求1所述的新型人源脂肪干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中无血清培养基包括如下组分：α-MEM、20％人源血小板裂解液、105U/LIF、5-10ng/mL b-FGF、5-10ng/mLTGF-β和500-1000IU/L肝素钠。

5.根据权利要求1所述的新型人源脂肪干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中细胞冻存液由以下组分组成：10％DMSO、40％HPL血清替代物和α-DMEM。

6.根据权利要求1或5所述的新型人源脂肪干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S4中冷冻保存的具体操作为将细胞冻存管在4℃下保存30分钟，然后在-20℃保存2小时，在-80℃保存一周以上后，转入液氮罐中长期保存。