[发明专利]一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法

权利要求书

1.一种利用基因工程菌制备利巴韦林的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备能够表达具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的pun基因片段的基因工程菌：

1)合成具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的pun基因片段；

2)将合成的pun基因片段与载体pET20b连接成重组质粒pET20b-BA-pun；

3)将重组质粒pET20b-BA-pun转化到大肠杆菌DH5α；

4)筛选阳性克隆，并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到基因工程菌BL21/pET20b-BA-pun，

(2)诱导表达步骤1)所述的基因工程菌，将诱导培养得到的菌液经离心和洗涤后，收集细胞菌体；

(3)以磷酸钾缓冲液为反应溶剂，以鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺为反应底物，在反应底物中加入上述细胞菌体作为酶源并混合均匀，其中鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺的摩尔比为1：1，所述鸟苷和1,2,4-三氮唑-3-甲酰胺在反应体系中的浓度为400mmol/L，所述细胞菌体的用量按湿重计为0.5％～5％的比例添加；

(4)将混合均匀后的反应体系放入摇床进行酶转化，所述酶转化反应温度为65℃，反应时间2h～24h；

(5)反应结束后将反应体系置于冰水浴中冷却，12000r/min离心5min得上清液，即为包括利巴韦林的溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中(2)诱导表达步骤(1)所述的基因工程菌的步骤包括：

将基因工程菌BL21/pET20b-BA-pun单菌落接种于含100μg/ml的Amp的LB液体培养基，220r/min、37℃条件下振荡培养12h～16h；然后以2％接种量将培养好的种子转接于含Amp的LB液体培养基，220r/min、37℃条件下振荡培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，18℃诱导表达18h。

3.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，所述磷酸钾缓冲液的浓度为50mmol/L，pH为7.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中细胞菌体的用量按湿重计为0.5％的比例添加。

5.根据权利要求1-2任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中酶转化的条件为：转速为300r/min。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)中反应时间为2h。