[发明专利]基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法

说明书

本发明公开了一种基于G‑四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器的黄体酮检测方法，与传统的黄体酮检测方法相比，其避免了贵重仪器的分析方法的建立；使用核酸适配体为识别元件提高了目标物检测的选择性和稳定性。将信号放大策略与电分析方法相结合，构建以黄体酮为检测对象的电化学传感新方法和新技术，提高分析的灵敏度。本发明检测黄体酮的方法更简便，更灵敏，选择性且成本效益更高，在痕量生物小分子分析中有着重要的实际意义和发展前景。

技术领域

本发明涉及一种基于G-四联体DNAzyme信号放大策略的适配体传感器构建及其在黄体酮检测中的应用，属于适配体传感技术领域。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

黄体酮是一类典型的内分泌干扰物质，其在人体或动物体中含量高于或低于某个阈值，均会对动物和人类产生不利影响。此外，当人类或动物摄入高剂量的黄体酮后，通常机体吸收的量很少，其余的则作为废物排放到污水中，并可能对环境造成影响。因此，在适当范围内监测环境或临床样品中黄体酮的浓度至关重要。目前检测黄体酮的方法主要是HPLC、LC/MS、酶联免疫吸附试验和放射免疫分析，但这些方法通常成本高，耗时长，操作步骤繁琐且需要经过专门训练的人员来执行，所以限制了它们的进一步应用。电化学检测方法由于具有低成本，快速，高灵敏性和易于小型化等优点，有望用于进行免贵重仪器分析方法的建立，其得到迅速的发展和应用，逐步成为应用最广泛的生物分析方法之一，涉及生物学检测的各个领域。

适配体是指经指数富集的配体系统进化技术体外筛选合成得到的一小段单链寡核昔酸序列，对目标分子具有高度亲和性和特异性的识别能力。与免疫传感器相比，核酸适配体与目标物间的亲合力常常要强于抗原抗体之间的亲合力。2015年，研究人员成功筛选出了黄体酮适体并开发了一种电化学适体传感器用于黄体酮的检测，检测限为2.86nM，与其分析方法相比，其成本更低，稳定性更高，检测策略更简单，成为检测目标物的又一极具优势的新方法。然而，这些适配体传感器大多按1:1的信号：目标物比例输出信号，无法实现更低浓度目标物的高灵敏检测。因此，将信号放大策略运用到适配体传感器中以提高检测的灵敏度，这对于检测低浓度生物分子具有重要意义。

杂交链放大技术(Hybridization Chain Reaction，HCR)是基于两个发夹分子的识别、杂交的连锁反应的一种新技术，是检测特定序列的一种无酶扩增技术。HCR技术是目前构建高灵敏生物传感器常用的扩增方法。此外，酶催化放大技术亦是电化学信号放大技术中运用较成熟的技术之一，DNA模拟酶是指由G-四联体序列与血红素(Hemin)组成的具有过氧化物酶活性的复合物，也被称为G-四联体DNAzyme。相比于HRP，G-四联体DNAzyme具有高的化学稳定性，成本低，简单合成，易于修饰等优点，正作为催化信标引起人们的极大关注，在分析测试中具有广泛的应用。G-四联体DNAzyme可催化H₂O₂氧化邻苯二胺(OPD)生成具有电化学活性的2,2′-氨基偶氮苯(DAP)，其可作为电化学信号指示剂。G-四联体DNAzyme这种独特的催化性能非常有利于基于信号放大策略用于检测黄体酮适配体传感器的构建。因此，利用G-四联体DNAzyme信号放大策略进行电化学传感分析方法的开发具有重大的实际意义。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)用于检测黄体酮的方法，如HPLC、LC/MS、酶联免疫吸附试验和放射免疫分析，这些方法成本高，耗时长，需要复杂昂贵的科学仪器和专业的操作人员，且不易于小型化。

(2)目前，用于黄体酮检测的适配体传感策略的研究较少，且黄体酮在生物基质中的检测具有挑战性，因为其浓度在1ng·mL^-1(1ng·mL^-1＝0.325nM)左右，甚至更低。而大多适配体传感器按1:1的信号：目标物比例输出信号，其灵敏度低，检测范围窄，无法实现低浓度目标物的高灵敏检测。

解决上述技术问题的难度：一种基于信号放大策略的高灵敏度、高选择性用于黄体酮检测的适配体传感器的构建。