[发明专利]一种仿病毒囊泡及其制备方法以及其用途

说明书

本发明公开了一种仿病毒囊泡及其制备方法以及其用途，该仿病毒囊泡由双分子层膜和所述双分子层膜内部包裹的分子探针构成，其中所述双分子层膜的表面具有融合基团。该仿病毒囊泡其中之一的制备方法为：先采用基因工程在所述双分子层表面修饰融合基团，然后粉碎双分子层和分子探针混合后，挤压得到仿病毒囊泡。本发明的仿病毒囊泡可与外泌体膜直接融合，从而将仿病毒囊泡内部的分子探针递送到外泌体内，进而检测外泌体内的核酸分子，实现外泌体内核酸分子的原位、准确、快速检测。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种仿病毒囊泡及其制备方法以及其用途。

背景技术

外泌体是一种由细胞分泌的、直径在40nm～100nm的细胞外囊泡。外泌体外层是磷脂双分子层，内含丰富的蛋白质、mRNA、miRNA、DNA片段等成分，参与细胞间的物质交换和信息交流。外泌体的形成始于细胞膜内陷发展形成内体，内体膜以向内出芽的形式形成多囊泡内体。一部分多囊泡内体与细胞内溶酶体结合，使其内容物降解；另一部分多囊泡内体与质膜融合，将外泌体释放到胞外空间。外泌体在血液、尿液、唾液、脑脊液等体液中具有很高的丰度，而不同来源的外泌体具有相应特异的功能，如清除过时分子，免疫调节与监视，细胞程序性死亡、血管生成、炎症、肿瘤细胞和癌基因传播等，在多种生理和病理过程中发挥重要作用，与疾病的发生与进程密切相关。因此，外泌体及其内容物的分析检测对疾病的早期诊断、疗效评估和预后分析具有重要意义。

目前临床疾病的诊断主要依靠影像学技术或组织活检，但是这几个经典的方法都有各自的缺点。通过影像学发现疾病最大的缺点就是滞后性。影像学对疾病有明确的判断和发现时，大多是疾病进展较为严重。实体组织学活检是疾病确诊的重要手段，是目前明确疾病的金标准。但是实体组织活检具有侵入性，而且对于早期疾病而言，也很难通过活检准确地获得病灶组织。因此急需寻找一个可用于肿瘤诊断的高灵敏检测方法。大量研究发现，疾病来源的外泌体中含有大量特异性核酸分子，可以作为重要标志物用于疾病的诊断、疗效评估和预后分析。相比于其他已知的诊断方法，检测外泌体内的核酸分子具有许多独特的优势：(1)外泌体广泛存在于各种体液中，而且含量丰富，例如，每毫升血液中循环肿瘤细胞仅有1～10个，而肿瘤外泌体含量高达109个；(2)外泌体取材方便、创伤小，可以在疾病的诊疗过程中多次取材，病人依从性好；(3)外泌体内核酸分子不是随机进入的，而是通过特殊的分拣机制进入的，因此更具特异性；(4)外泌体内核酸分子具有外泌体膜保护，使其免受体液内核酸酶降解，可以稳定存在。分析检测外泌体内的核酸分子，有利于疾病的诊断及疗效分析，具有极其重要的科研和临床意义。

目前检测外泌体内部核酸分子的主要步骤是先分离外泌体，再检测内部分子。外泌体的分离方法有差速离心法、尺寸排阻法、亲和富集法、超滤法等，但这些方法均存在一定的问题，例如使用差速离心法分离外泌体，虽然获得的囊泡较多，但由于细胞外囊泡种类多样，该方法所得产物中常包含其他类型的囊泡和蛋白质聚集体，而重复的超高速离心步骤又会造成外泌体的破坏；尺寸排阻法利用颗粒大小进行分离，产物纯度高，但是上样量小，不适合大量样品分析；虽然一些新兴的芯片技术也不断出现，但仅适于检测外泌体表面的标志物。此外，最重要的是通过上述几种方法得到外泌体后，在提取核酸分子的过程中均需要对外泌体的结构进行破坏，这一过程容易造成核酸分子的降解和损失，影响最终检测结果的准确性。