[发明专利]防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法

说明书

本发明公开了一种防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，包括：步骤一、向干燥的山银花叶片加入PVP和维生素C研磨成细粉；步骤二、向细粉加入CTAB提取缓冲液和β‑巯基乙醇的混合液混合，然后水浴加热，得悬浮液；步骤三、冷却至室温，加入氯仿和异戊醇混合溶剂混合均匀，离心，取上清液；步骤四、向上清液加入异丙醇，混合均匀得待提液；步骤五、将待提液转移至DNA提取试剂盒的离心柱中，离心，弃废液；步骤六、向离心柱加入乙醇，离心，弃废液，将离心柱晾干至无乙醇；步骤七、向离心柱加入TE缓冲液，离心，收集收集管中的溶液，即为山银花叶片DNA溶液。本发明具有防止山银花叶处茸毛堵塞离心柱的有益效果。

技术领域

本发明涉及DNA提取领域。更具体地说，本发明涉及一种防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法。

背景技术

山银花属忍冬科忍冬属植物(Lonicera L.)，产于我国南方各地，是一种大量应用中药材，具清热解毒、疏散风热的功效，用于痈肿疗疮、风热感冒、温热发病等。《中华人民共和国药典》规定山银花的来源为忍冬科植物灰毡毛忍冬L.macranthoides Hand.-Mazz.、红腺忍冬L.hypoglauca Miq.、华南忍冬L.confuse DC.或黄褐毛忍冬L.fulvotomentosa Hsuet S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花。现代药理研究表明，山银花含有绿原酸(chlorogenic acid)、异绿原酸(isochlorogenic acid)、咖啡酸(caffeic acid)等成分，具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤及解热抗炎、利胆、保肝、抗溃疡等多种生物活性。近年来，分子标记技术在忍冬属植物的遗传多样性、品种鉴定、分类等方面得到了广泛运用，DNA分子生物学研究已成为近年来生物学领域的研究热点和方向，这些研究多数都是以幼叶为材料提取基因组DNA，材料中的酚类、多糖等次生物质给山银花核酸的提取增加了一定的难度，山银花的材料多覆盖茸毛，尤其是嫩叶，而通常嫩叶又是提取核酸的最佳材料，这是核酸提取的一大障碍。前人的改良CTAB法一定程度上提高了DNA提取的得率，但是无法满足目前高通量核酸提取的要求，因此，离心柱型的植物基因组DNA提取试剂盒得到广泛的应用，但目前针对酚类多糖，尤其是覆盖毛被的植物材料来说，试剂盒无法满足这种高通量和高质量的DNA提取要求，影响了分子生物学的后续研究，为了解决这些问题，本研究针对试剂盒法进行改良，得出一种快捷、高得率、高质量的山银花基因组DNA提取方法，为开展山银花分子生物学研究提供了技术基础。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，可以去除山银花叶片的茸毛，以防止茸毛堵塞离心柱孔，再采用离心柱方法提取DNA，从而减少提取时间。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种防止茸毛堵塞离心柱的山银花干燥叶片DNA提取方法，包括：

步骤一、向干燥的山银花叶片加入PVP和维生素C，研磨成细粉；

步骤二、向细粉中加入CTAB提取缓冲液和β-巯基乙醇的混合液，混合至细粉完全悬浮，然后于65℃水浴加热30～45min，在水浴加热期间摇匀，得悬浮液；

其中，CTAB提取缓冲液与山银花叶片的体积质量比为700μL:0.02～0.04g，混合液为体积分数为2％的β-巯基乙醇的CTAB提取缓冲液，悬浮液与PVP的体积质量比为100mL:1g，悬浮液与维生素C的体积质量比为100mL:1g；

步骤三、悬浮液冷却至室温，加入氯仿和异戊醇混合溶剂混合均匀，离心，取上清液；

步骤四、向步骤三中的上清液加入异丙醇，混合均匀得待提液；

步骤五、将步骤四中的待提液转移至DNA提取试剂盒的离心柱中，离心，弃掉收集管中的废液；