[发明专利]一种基于多巴胺脱羧酶催化产多巴胺的方法

说明书

本发明公开了一种基于多巴胺脱羧酶催化产多巴胺的方法，该方法具体包括以下步骤：构建表达多巴脱羧酶（DDC）的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a‑DDC；培养基因工程菌BL21（DE3）/pET28a‑DDC并诱导表达DDC；收集上述菌体，用缓冲液重悬菌体后，超声破碎，离心去除杂质，得DDC的粗酶液；以多巴为底物，加入0.1‑1mM磷酸吡哆醛后调节反应体系的pH，加入DDC粗酶液反应得产物多巴胺。本发明方法是首次系统的做出从多巴到多巴胺的酶催化生产工艺，催化效率高达7.4g/l，转化率高达95％以上，环境友好，原料易得，生产成本低，工艺简单，反应条件温和，具有很好的工业化生产前景。

技术领域

本发明属于生物酶催化技术领域，尤其涉及一种基于多巴胺脱羧酶催化产多巴胺的方法。

背景技术

多巴又称二羟苯丙氨酸，左旋多巴，由酪氨酸氧化产生的一种氨基酸，能通过血脑屏障，于体内转变为多巴胺。医疗上用于震颤麻痹症的治疗。

多巴胺为多巴胺受体激动药。多巴胺是脑内一种重要的神经递质，多巴胺能系统与神经精神性疾病密切相关，多巴胺是人体能自行合成的物质、有增强心肌收缩、增加心排血量、升高动脉血压、抗休克作用。由于它的突出生理功能，多巴胺人工合成的成功，使它成为抗休克的合成药物。经临床应用表明，多巴胺对于不同类型的休克均有显著疗效。为当今治疗帕金森病，药物依赖和精神分裂症等中枢神经疾病的药物开发，有着重要的理论研究意义和应用前景。多巴胺的合成难度大，成本高，对产品的纯度要求高，产量较少。因此，提供一种可以有效经济产生多巴胺是非常必要的。

现有技术生产多巴胺的方法，其中化工生产转化率低，成本高，污染严重，生物合成方法周期长，提取困难，本发明方法用的酶催化法，催化效率以及转化率高，环境友好，工业化前景好，是一种新型的酶催化方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于多巴胺脱羧酶催化产多巴胺的方法，该方法绿色环保，且与化学生产方法简单，成本低廉，适合产业化。

为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

一种基于多巴胺脱羧酶催化产多巴胺的方法，包括以下步骤：

步骤1，构建表达多巴脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC；

步骤2，培养多巴脱羧酶的基因工程菌BL21（DE3）/pET28a-DDC；

步骤3，收集步骤2中的基因工程菌，用pH5-9的缓冲液重悬后，超声破碎仪破碎；离心去除杂质，得到多巴脱羧酶的粗酶液；

步骤4，选取多巴作为底物，加入0.1-1mM磷酸吡哆醛，再添加缓冲溶液调节反应体系的pH至5-9，最后加入多巴脱羧酶粗酶液0.5-2g/l，40-45℃反应0.5h-3h，得到产物多巴胺，反应体系中底物多巴的终浓度不超过6g/l。

当反应结束后，可通过高效液相色谱法进行检测多巴胺。检测方法为Agilent1260 高效液相色谱；采用Agilent TC-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm,5μm）;以0.1%三氟乙酸溶液-乙腈（96:4）为流动相;流速1.0 ml·min^-1;检测波长为280nm;柱温:室温。

作为改进的是，步骤1中所述构建表达多巴脱羧酶的基因工程菌的方法如下 ：根据已报导的异色瓢虫来源多巴脱羧酶DDC的氨基酸序列（GenBank: AMQ13055.1）进行密码子优化后，全基因合成该序列，亚克隆到载体pET28a上，获得重组质粒pET28a-DDC，将构建好的重组质粒pET28a-DDC用氯化钙法转化进入大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到多巴脱羧酶表达菌种BL21（DE3）/pET28a-DDC。