[发明专利]一种低含量脂肪酸杂质的长链二元酸及其生产方法有效
申请号: | 201910255480.9 | 申请日: | 2019-04-01 |
公开(公告)号: | CN110684783B | 公开(公告)日: | 2023-08-08 |
发明(设计)人: | 刘文波;徐敏;杨晨;周豪宏;刘修才 | 申请(专利权)人: | 上海凯赛生物技术股份有限公司;CIBT美国公司 |
主分类号: | C12N15/53 | 分类号: | C12N15/53;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N15/65;C12N15/90;C12P7/6409;C12R1/15;C12R1/645;C12R1/72;C12R1/84;C12R1/74 |
代理公司: | 北京永新同创知识产权代理有限公司 11376 | 代理人: | 程大军;栾星明 |
地址: | 201203 上海市浦东新*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 含量 脂肪酸 杂质 二元酸 及其 生产 方法 | ||
本发明涉及一种低含量脂肪酸杂质的长链二元酸及其生产方法,具体涉及利用定向进化和同源重组方法制备长链二元酸菌株、利用该菌株发酵生产低含量脂肪酸杂质的长链二元酸。本发明涉及一种分离的突变的CPR‑b基因、其同源基因或其变体,其相对于GenBank登录号AY823228,以起始密码子ATG上游第一位碱基为‑1计,具有碱基突变‑322GA以及以终止密码子TAG下游第一位碱基为1计,具有突变3'UTR.19CT和3'UTR.76_77insT。本发明还涉及含有所述突变的CPR‑b基因、同源基因或变体的菌株,该菌株发酵生产长链二元酸时,其发酵产物中脂肪酸杂质的含量显著降低。
技术领域
本发明涉及一种低含量脂肪酸杂质的长链二元酸及其生产方法,以及利用定向进化和同源重组方法制备长链二元酸菌株、利用该菌株生产低脂肪酸杂质含量的长链二元酸的方法。
背景技术
长链二元酸(LCDA;也称为长链二羧酸或长链二酸)包括化学式HOOC(CH2)nCOOH的二元酸,其中n≥7。长链二元酸作为重要的单体原料,广泛用于合成尼龙、树脂、热熔胶、粉末涂料、防腐剂、香料、润滑剂、塑化剂等。
长期以来,长链二元酸经由石油通过传统的化学合成途径如丁二烯多步氧化法合成。但化学合成法面临多种挑战,化学合成法得到的二元酸为长链二元酸与短链二元酸的混合物,因此需要复杂的后续提取纯化步骤,对于生产工艺和生产成本而言,都是巨大的障碍。采用微生物发酵技术生产长链二元酸,因其产生的污染低、环境友好、能够合成化学合成方法难以合成的产物如12碳以上的长链二元酸且纯度高等特点,较传统的化学合成法具有明显的优势。
但是微生物发酵技术生产的长链二元酸,有时会在产物中残留杂质,产品纯度的降低会严重影响产品的质量,对后期应用造成极大地影响。尤其是与长链二元酸特性比较类似的杂质,其不仅对后期的提取纯化带来了巨大的技术挑战,而且对于生产成本控制而言也会造成严重的负面影响。因此对于生产长链二元酸菌株进行遗传改造,以降低发酵过程中一些特定杂质的含量,对于生物合成法生产二元酸具有重要的意义和生产价值。
此前,二元酸菌种的改良大多通过传统的随机诱变或采用基因工程的方法得以实现,由于诱变本身随机性的特点,对筛选通量有很高的要求,而且每一次对于性状改变都要求新一轮的诱变筛选,在技术上已经成为重要的限制因素。采用基因工程的手段可以对菌株进行有针对性的遗传改造,从而获得产率更高的优良菌株。长链二元酸微生物发酵法生产方法主要为烷烃经ω-氧化生成。继而又可以经过β-氧化途径而被降解。以往的研究表明,可以通过增强ω-氧化途径并抑制β-氧化途径的手段来提高长链二元酸的产率。Coginis公司的Pictaggio等(Mol.Cell.Biol.,11(9),4333-4339,1991)报导敲除POX4和POX5各两个等位基因可以有效阻断β-氧化途径,从而达到底物100%的转化率。进一步过量表达ω-氧化途径中的限速步骤的两个关键酶P450及氧化还原酶CPR-b基因,可以使产量得到有效提升。赖小勤等(中国发明专利CN103992959B)报道向二元酸生产菌株中引入一个拷贝的CYP52A14基因也可以有效提高二元酸的转化率和生产效率。另外清华大学曹竹安等人(Biotechnol.J.,1,68-74,2006)发现敲除乙酰辅酶A由过氧化物酶体向线粒体运输过程中的关键基因CAT中的一个拷贝,从而部分阻断乙酰辅酶A进入柠檬酸循环,也可以有效降低二元酸的降解。
易错PCR是Leung等(Technique,1,11-15,1989)最早提出的构建基因文库进行定向研究的技术。通过改变PCR反应条件,如调整反应体系中四种脱氧核糖核酸的浓度、改变Mg2+的浓度以及使用低保真度的DNA聚合酶等方法,使碱基错配而引入突变。过高或过低的突变率都会影响构建突变库的效果,理想的碱基突变比例是每个DNA片段1-3个。因此利用易错PCR产生随机突变,并结合同源重组的方法进行基因的定向遗传学改造,可以帮助筛选对菌株产能进一步提高有帮助的有益突变。
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