[发明专利]一种调控杨树木材形成的油菜素内酯合成限速基因及其应用

权利要求书

1.一种调控杨树木材形成的油菜素内酯合成限速基因，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。

2.权利要求1所述调控杨树木材形成的油菜素内酯合成限速基因的表达蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

3.包含权利要求1所述调控杨树木材形成的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。

4.构建权利要求3所述调控杨树木材形成的油菜素内酯合成限速基因的植物表达载体的方法，其步骤如下：

(1)利用通路克隆技术构建PagDET2基因的过量表达载体，使用特异PCR引物，以银腺杨cDNA为模板，进行PCR扩增，将PagDET2基因CDS构建到入门载体，入门载体为PDNOR207，序列如序列表中序列6所示；

反应体系为Fresh PCR product 80ng；PDNOR207 vector 0.4μl；BP ClonaseⅡenzyme mix 0.6μl；无菌ddH₂O补足至5μl，反应程序为：25℃反应5h，从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证；

(2)将带有PagDET2基因的入门载体通过Mlu I限制性内切酶线性化后，Gateway体系构建至植物表达载体pMDC32，序列如序列表中序列7所示，进行LR反应；

反应体系为：Linearized entry clone 50ng；purified destination vector 75ng；LR Clonase Ⅱenzyme mix 0.6μl；TE buffer，pH 8.0，补足5μl，反应条件：25℃反应5h，经LR反应后，PagDET2基因导入植物表达载体pMDC32中，在PagDET2基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，使PagDET2基因在杨树体内高效表达；在PagDET2基因的3’端组装有强终止子NOS，有效终止PagDET2基因的转录，得到植物表达载体pMDC32-PagDET2；

(3)在载体质粒上组装潮霉素磷酸转移酶HPT，作为转基因杨树的筛选标记，用潮霉素进行转基因杨树的筛选，在载体质粒组装LB和RB序列，促使组装于其间的PagDET2基因表达框架和筛选标记基因HPT整合至杨树受体染色体中，通过PCR检测及测序验证，确认过量表达载体构建成功，命名为pMDC32-PagDET2；其中，所述PagDET2基因为调控杨树木材形成的油菜素内酯合成限速基因，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示；所述特异PCR引物为序列表中序列4所示CDS正向引物和序列表中序列5所示CDS反向引物。

5.权利要求1所述调控杨树木材形成的油菜素内酯合成限速基因的遗传转化的方法，其步骤如下：

通过电击法，将权利要求4中所构建的pMDC32-PagDET2过量表达载体转入农杆菌GV3101中，通过农杆菌介导，将PagDET2基因转入杨树；其中，所述PagDET2基因为调控杨树木材形成的油菜素内酯合成限速基因，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示。

6.权利要求1所述调控杨树木材形成的油菜素内酯合成限速基因在调控杨树的木质部生长发育过程中的应用。