[发明专利]一种高效清除细胞培养过程中支原体污染的配方

说明书

本发明的高效清除细胞培养过程中支原体污染的配方，由抗菌肽BMAP‑18和BMAP‑18‑R9组成，其中BMAP‑18具有杀灭细胞外支原体的功能；BMAP‑18‑R9在R9穿膜肽的作用下进入到细胞中，杀灭细胞内的支原体。两者相结合就可以彻底杀灭细胞内外的支原体。同时，这两者单独使用和联合使用，200uM浓度内，对细胞没有毒性作用。

技术领域

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种清除细胞培养过程中支原体污染的配方。

背景技术

支原体是一种大小仅为0.2-0.3 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45um）的原核生物，在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题。当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉，最终，导致实验结果重现性差等严重问题。

目前，已有文献报道BMAP-18是一种抗菌肽可以清除常见的致病菌（https://doi.org/10.1016/j.peptides.2011.03.024），但是没有报道其可以清除支原体。R9是由9个R组成的氨基酸序列，是一个人工设计的穿膜肽（CPPs）。我们通过实验发现BMAP-18对细胞培养污染的支原体有一定的清除效果，但是无法做到100%的清除，可能的原因是BMAP-18无法清除细胞内部的支原体。因此，我们引入穿膜肽R9，将BMAP-18带入到细胞内，达到彻底杀灭胞内支原体的目的。

鉴于此，我们设计并验证了一种新的抗菌肽组合，可以作为清除细胞培养过程中支原体污染的有效。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是开发一种可以同时杀灭细胞内和细胞外支原体的抗菌肽配方。

本发明的抗菌肽配方，所述抗菌肽是由BMAP-18和BMAP-18-R9组合而成。其中的BMAP-18可以清除常见的致病菌和支原体。BMAP-18-R9不仅可以清除常见的细胞外致病菌和支原体，也可以同时清除细胞内常见的致病菌和支原体。所述抗菌肽BMAP-18的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述SEQ ID NO.2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，其中：

图1为本发明的BMAP-18清除胞外支原体的验证实验结果图；

图2为本发明的BMAP-18-R9清除胞内支原体的验证实验结果图；

图3为本发明的BMAP-18和BMAP-18-R9混合使用清除胞内支原体的验证实验结果图；

图4为本发明的BMAP-18和BMAP-18-R9细胞毒性实验结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。试验例中所涉及的BMAP-18和BMAP-18-R9，委托第三方公司采用化学合成方式获得，稀释成1M的储存母液，-20℃保存备用。所用的阳性对照支原体种类为猪鼻支原体(M.Hyorhinis)。采用检测方法为商业化的PCR检测试剂盒。

试验例1

本实施例的BMAP-18杀灭细胞外支原体的验证步骤为：

1、将支原体污染的细胞上清弃去，PBS清洗三遍后，加入混入BMAP-18的完全培养基，使得终浓度为100uM；

2、连续培养三天，每天重复上一步操作1次；

3、连续培养四天，胰酶消化细胞并用PBS重悬，2000g离心20min；