[发明专利]一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其应用

说明书

本发明提供了一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其应用，属于生物工程技术领域，所述制备方法包括以下步骤：1)将脂肪干细胞与电转染工作液混合，得到混合液，将所述混合液与CTF1质粒混合，得到预转染物；2)将所述步骤1)得到的预转染物进行电击，得到转染CTF1基因的脂肪干细胞；3)将所述步骤2)得到的转染CTF1基因的脂肪干细胞进行常规培养后，收集脂肪干细胞外泌体。采用本发明提供的方法制备得到的脂肪干细胞外泌体可显著促进子宫内膜微血管内皮细胞增殖。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞及其应用。

背景技术

血管新生为胚胎附着部位的子宫内膜建立了丰富的血液循环，为胚胎植入提供了物质基础。子宫内膜下血流越丰富，子宫内膜容受性越好，越利于胚胎着床。通过干预子宫内膜血管新生过程增加内膜血供，改善子宫内膜容受性，是提高胚胎种植率的重要手段。阿司匹林被认为可增加子宫及卵巢血流灌注，从而提高胚胎种植率及临床妊娠率而被广泛应用于临床，然而其疗效仍存在争议，近年来亦有研究发现阿司匹林并不能提高临床妊娠率、活产率,及减少流产率等，且患者孕期服用阿司匹林有引起出血等不良反应。近年来研究还发现枸橼酸西地那非片能降低子宫内膜血流阻力，使子宫内膜血管计数增加，从而改善子宫内膜血流灌注，促进子宫内膜生长，有利于胚胎着床，提高临床妊娠率。然而临床应用枸橼酸西地那非片可出现头痛、面色潮红、消化不良、鼻塞和视觉功能异常等不良反应，且尚无临床证据证明其是否对胎儿造成不利影响，而且使用枸橼酸西地那非片的患者仍有一部分疗效不满意。因此寻找一种效果可靠、副作用小的改善子宫内膜血流，提高子宫内膜容受性的治疗方法仍是临床应用急迫需要研究的热点问题之一。

间充质干细胞具有强大增殖及多向分化能力、免疫调节、促进血管新生等潜能。其中脂肪组织来源的干细胞具有自我更新能力及多向分化潜能，相比于其他来源的干细胞具有来源广泛、取材方便、损伤小、增殖速度快、免疫原性低、表型稳定等优点，而日益受到学者们的广泛关注和重视。脂肪干细胞分泌的因子可促进微血管内皮细胞的增殖、细胞迁移和血管新生以及增加血管数量。然而多项临床前瞻性研究发现干细胞移植远期临床效果欠佳。其中脂肪干细胞移植效率低下、存活率低等问题是制约临床干细胞移植应用的瓶颈。研究显示通过静脉注射途径少于5％的MSC能到达损伤部位，大部分的干细胞在给药后的几个小时内凋亡，即使到达靶组织的MSC中只有少量长期停留在损伤部位。另外研究发现MSC移植可能存在微血管栓塞、体内成瘤等安全问题亦限制其临床应用。近来脂肪干细胞分泌的膜性微囊泡外泌体引起了学者们的广泛关注和重视，成为干细胞研究领域的热点。脂肪干细胞外泌体可以模拟间充质干细胞生物学功能，发挥其促进血管新生、改善缺血组织的血流灌注、组织修复、免疫调节等作用。而且外泌体不具备细胞核结构，在宿主体内不能扩增，无异倍体性的风险，脂肪干细胞外泌体能够穿过质膜，并且发生免疫排斥的可能性更小，在临床应用过程中具有较好的安全性，且不会像脂肪干细胞那样容易堵塞微血管，突破了脂肪干细胞治疗存在的较多问题，具有更广阔的临床应用前景。

脂肪干细胞外泌体的促血管新生作用受其所在体内/体外所处微环境的影响，炎症及低氧条件能调控外泌体的合成和包装，影响其促血管生成作用。在研究工作中发现脂肪干细胞外泌体对促进子宫内膜微血管内皮细胞增殖作用较弱，因此如何增强体外获取的脂肪干细胞外泌体促血管新生作用是需要解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备脂肪干细胞外泌体的方法、脂肪干细胞外泌体及其应用，采用本发明的制备方法制备得到的脂肪干细胞外泌体提高了子宫内膜微血管内皮细胞增殖。

本发明提供了一种制备脂肪干细胞外泌体的方法，包括以下步骤：

1)将脂肪干细胞与电转染工作液混合，得到混合液，将所述混合液与CTF1质粒混合，得到预转染物；

2)将所述步骤1)得到的预转染物进行电击，得到转染CTF1基因的脂肪干细胞；