[发明专利]制备载脂蛋白A-I的方法

说明书

本发明涉及从含Apo A‑I的蛋白质级分(A)获得Apo A‑I的方法，包括悬浮含Apo A‑I的蛋白质级分(A)在缓冲溶液(B)中，从悬浮液中除去杂质，同时保持增溶的Apo A‑I蛋白质，随后从悬浮液中沉淀Apo A‑I和收集Apo A‑I沉淀物。通过这样的方法获得的Apo A‑I，由这种Apo A‑I获得的重构的高密度脂蛋白，和包括这样的Apo A‑I和/或重构的高密度脂蛋白等的药物组合物也被提供。

本申请是申请号为201480032030.9、申请日为2014年6月5日、发明名称为“制备载脂蛋白A-I(Apo A-I)的方法”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及从含有Apo A-I的蛋白质级分回收载脂蛋白A-I(Apo A-I)的方法。

背景技术

人载脂蛋白A-I是(HDL)的主要蛋白质组分，其是在血液中的重要脂蛋白。它是由肝脏和小肠合成并负责的HDL在血中的生理功能；从外周组织去除胆固醇，将其运载回肝脏或其它脂蛋白，这通过被称为“反向胆固醇运输”(RCT)的机制。

根据流行病学和纵向研究，血清胆固醇水平的升高和冠状动脉心脏疾病的发展之间的明显的相关性已被多次证实。

因此，高密度脂蛋白(HDL)中的Apo A-I被认为具有抗炎功能和抑制冠心病的发生和发展。此外，Apo A-I已经显示出降低血液中低密度脂蛋白(LDL)水平和已知结合到内毒素，从而在高密度脂蛋白的抗内毒素作用中具有主要作用。

高密度脂蛋白和Apo A-I的“保护性”的作用作为其主要性质已在多项研究中被证实，使得Apo A-I成为有希望的候选物(特别是作为重构的HDL的一部分)，用于在动脉粥样硬化治疗，急性冠脉综合征的治疗(ACS)，抗炎治疗，抗毒素治疗，肝靶向药物等中的应用。

现今人血浆大量被收集和处理成各级分，其中一些含有载脂蛋白A-I。所述级分可能由乙醇分级分离根据在美国最初开发和称为科恩或科恩-Oncley方法的方法来制备[E.J.Cohn等人,J.Am.Chem.Soc.68,459-475,1946；J.L.Oncley等人,J.Am.Chem.Soc.71,541-550,1949]。含有载脂蛋白的血浆组分也可通过这种方法的一个变体，Kistler-Nitschmann方法来制备[H.Nitschmann等人,Helv.Chim.Acta 37,866-873,1954；P.Kistler and H.Nitschmann,Vox Sang 7,414-424,1962]。这两种方法都基于示差沉淀醇。

各种方法已在文献中被描述从乙醇沉淀级分回收载脂蛋白A-I：

例如，US5089602涉及通过再悬浮级分在pH范围为3至5或6至9的含水缓冲溶液，从人血浆或血清级分制备载脂蛋白。通过加入短链脂肪醇析出不良污染物。使用了含有高乙醇浓度的(68-96％乙醇)缓冲液进行沉淀污染物。通过升高的温度，微碱性pH值，或者通过加入离液剂或表面活性物质(其随后通过凝胶过滤除去)抑制脂蛋白的潜在聚合。阴离子交换层析步骤被包括以结合污染物，而载脂蛋白通过。

Kim等人，Manufacturing and Shelf Stability of Reconstituted High-density Lipoprotein for Infusion Therapy,Biotechnology and BioprocessEngineering 16,785-792(2011)公开了使用含有在6M的浓度的脲的提取缓冲液。