[发明专利]金钱松的荧光PCR检测试剂及方法

说明书

本发明公开了金钱松的荧光PCR检测试剂及方法，该荧光PCR检测试剂引物序列分别为TTGTCTCTGC ATTTGGATTC GT和CCTGCTCCCT GGCGATTA，探针序列为TGCCCCTTCG TTGCGTGATG C，探针含有FAM荧光报告基团，检测方法样品DNA提取、荧光PCR检测和鉴别，该荧光PCR检测试剂对金钱松特异性和灵敏性，该检测方法可以快速检测金钱松，尤其是形态学难以鉴别的落叶阶段，10^‑1～10^‑5倍稀释液样本均能够得到典型扩增曲线。

技术领域

本发明涉及金钱松的鉴定，具体涉及金钱松的荧光PCR检测试剂及方法。

背景技术

金钱松属松科金钱松属，为我国特有的单种属植物，被列入中国珍稀濒危保护植物名录，属于国家Ⅱ级重点保护物种，金钱松不仅是重要的庭院植物，同时也是一种应用前景广泛的药用植物。宁波口岸每年出口金钱松盆景约6000盆，目前查验以形态学鉴定为主，而出口季节为冬季落叶阶段，因此急需制定形态学和分子生物学相结合的《金钱松鉴定方法》，为进出境物种资源查验工作提供执法技术支持。目前金钱松的分子生物学研究以分析其遗传多样性为主，尚无分子生物学鉴定方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种金钱松的荧光PCR检测试剂及方法，该荧光PCR试剂可以快速、特异、灵敏鉴定金钱松，尤其是形态学难以鉴别的落叶阶段。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：金钱松的荧光PCR检测试剂，该荧光PCR检测试剂引物和探针的核苷酸序列如下所示：

上游引物：5′-TTGTCTCTGCATTTGGATTCGT-3′

下游引物：5′-CCTGCTCCCTGGCGATTA-3

探针：5′-FAM-TGCCCCTTCGTTGCGTGATGC-Eclipse-3′。

引物和探针是根据GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih. gov)中已登录的金钱松的基因序列-内源基因参照SN/T 1204-2016中18SrRNA序列，采用Blast程序进行同源性比较，在同源性序列的高度保守区采用Primer Express 3.0软件设计得到金钱松的特异性引物与探针，探针5′端含有FAM荧光报告基团，3′端含有不发荧光的淬灭基团Eclipse。

利用金钱松的荧光PCR检测试剂检测金钱松的方法，其步骤如下：

样品DNA提取：取100mg粉样于1.5mL离心管中，加入600µL CTAB提取液，充分振荡混匀，65℃水浴30min，不时颠倒混匀；然后10000r/min离心5min，取上清，上清用该上清等体积的氯仿异戊醇混合液抽提，抽提完毕取上清，加入该上清2倍体积CTAB沉淀液，室温沉淀1h，12000r/m离心10min，弃上清；加入350µL NaCl饱和溶液溶解沉淀，再用350µL氯仿异戊醇混合液抽提，取上清，上清中再加入该上清等体积的异丙醇，4℃沉淀至少10min，然后12000r/m离心10min，弃上清；质量浓度70%的乙醇洗涤1～2次，晾干后，加入100µL TE缓冲液溶解沉淀，得到样品DNA模板，4℃保存备用，上述氯仿异戊醇混合液中三氯甲烷:异戊醇体积比为24:1；

荧光PCR检测：取样品DNA模板4µL，加入下述检测试剂：Probe qPCR Master Mix-2×缓冲液10µL，浓度为10µmol/L上游引物0.4µL，浓度为10µmol/L上游引物0.4µL，浓度为10µmol/L探针0.8µL，ROX0.4µL，用纯水补至20µL；50℃去污染2 min，检测反应参数为：预变性95℃ 10min；95℃ 15s, 60℃ 30s，40个循环；

鉴别：荧光PCR检测有荧光响应则为金钱松，也可以进一步分析扩增曲线，有典型的扩增曲线就为金钱松。