[发明专利]RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞基因表达影响的测定方法

说明书

本发明属于基因表达检测技术领域，涉及RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞基因表达影响的测定方法。所述的测定方法依次包括如下步骤：(1)培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞；(2)对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞进行siRNA转染；(3)检测大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞中ORC1基因的表达情况，确定表达量相对于细胞未转染siRNA时的变化；(4)确定ORC1基因表达的变化对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖能力的影响、表型的影响、细胞形态结构的影响、细胞中标志蛋白表达量的影响。利用本发明的RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞基因表达影响的测定方法，能够确定ORC1基因与血管平滑肌细胞(VSMC)之间的关系，确定RNA干扰对ORC1基因的介导作用。

技术领域

本发明属于基因表达检测技术领域，涉及RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞基因表达影响的测定方法。

背景技术

平滑肌(smoothmuscle，plainmuscle)是无纹肌(non-striatedmuscle)的通称，是较横纹肌原始的一种肌肉。平滑肌不但作为无脊椎动物的躯体肌而有广泛分布，而且脊椎动物除心肌之外的大部分内脏肌也是由平滑肌构成的。

平滑肌细胞呈梭形，直径2-5μm。平滑肌细胞长度可变性很大，大约长度为400μm时是产生张力的最适长度。推测平滑肌肌浆中有大量细肌丝存在，它们的排列大致与细胞长轴平行。平滑肌细胞中的细肌丝有同骨骼肌类似的组成，但不含肌钙蛋白，且相同体积的平滑肌所含肌纤蛋白的量是骨骼肌的2倍。平滑肌胞浆中肌凝蛋白的量只有骨骼肌的1/4。

平滑肌没有骨骼肌和心肌那样发达的肌管系统。平滑肌肌细胞膜只有一些纵向排列的袋状凹入，这使得细胞膜表面积和细胞体积之比更大，因此使肌丝靠近的不是横管或肌浆网系统，而是肌膜。平滑肌细胞被激活时，细胞外Ca²⁺进入膜内，使细胞中靠近膜的肌浆网形成了细胞内Ca²⁺贮存库。

然而，现有RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞基因表达影响的测定无法表明ORC1基因与血管平滑肌细胞(VSMC)之间的关系，也无法确定RNA干扰对ORC1基因的介导作用

发明内容

本发明的目的是提供RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞基因表达影响的测定方法，以能够通过该测定方法确定ORC1基因与血管平滑肌细胞(VSMC)之间的关系，确定RNA干扰对ORC1基因的介导作用。

为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞基因表达影响的测定方法，所述的测定方法依次包括如下步骤：

(1)培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞；

(2)对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞进行siRNA转染；

(3)检测大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞中ORC1基因的表达情况，确定表达量相对于细胞未转染siRNA时的变化；

(4)确定ORC1基因表达的变化对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖能力的影响、表型的影响、细胞形态结构的影响、细胞中标志蛋白表达量的影响。

在一种优选的实施方案中，本发明提供RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞基因表达影响的测定方法，其中步骤(1)中，用组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞。

在一种优选的实施方案中，本发明提供RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞基因表达影响的测定方法，其中步骤(1)中，还对培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞在倒置显微镜下进行形态学观察，通过免疫荧光法检测α-SM-actin以进行细胞鉴定。

在一种优选的实施方案中，本发明提供RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞基因表达影响的测定方法，其中步骤(2)中，使用阳性脂质体Lipofectamine2000对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞进行siRNA转染。