[发明专利]一种几丁质酶CmChi6基因及其克隆表达与应用

权利要求书

1.一种几丁质酶CmChi6基因，其特征在于，所述几丁质酶CmChi6基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.一种重组表达载体，含有权利要求1所述的编码几丁质酶CmChi6基因的核苷酸序列的重组表达载体。

3.一种基因工程化的宿主细胞，所述的基因工程化的宿主细胞转化了如权利要求2所述的重组表达载体。

4.基于权利要求1述的几丁质酶CmChi6基因的克隆表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，PCR扩增SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

步骤2，构建大肠杆菌质粒载体pColdI- Cmchi6

将PCR扩增的DNA序列和pColdI载体用同样的限制性内切酶NdeI和HindIII 进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T₄DNA连接酶连接，得到质粒载体pCooldI- Cmchi6；

步骤3，构建大肠杆菌克隆菌株pColdI- Cmchi6- E.coliTrans1T1

将质粒载体pColdI- Cmchi6转化至E.coli Trans 1T1，得到阳性转化子，经筛选并测序确定为目标菌株；

步骤4，构建大肠杆菌表达菌株pColdI- Cmchi6-BL21(DE3)

将克隆菌株pColdI- Cmchi6- E.coli Trans1T1提取出来的质粒转化至E.coliBL21(DE3)，挑选阳性转化子克隆，得到重组表达菌株pColdI- Cmchi6-BL21(DE3)；

步骤5，体外诱导表达

将重组表达菌株pCooldI- Cmchi6-BL21(DE3)接入5ml含氨苄霉素的摇管LB培养基中，于25-40℃过夜培养后，按1%的接种量接种到100ml含氨苄霉素的LB培养基中，当OD₆₀₀=0.4-0.6，加入终浓度为0.5mM-1 mM的IPTG进行诱导，于16-25℃，150-250rpm低温培养20-24h；

步骤6，几丁质酶获得

体外诱导表达结束后于4℃，6000-12000rpm离心7-10min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体三次，再用PBS缓冲液重悬菌体，之后置于冰上超声破碎，每次10-15min，超声2秒间隔3秒，然后于4℃，6000-12000rpm离心7-10min收集上清液，即得重组几丁质酶CmChi6粗酶液。

5.根据权利要求4所述的几丁质酶CmChi6基因的克隆表达方法，其特征在于，步骤1中PCR扩增所用的引物为上游引物Chi-F：5’-CATATGATGGCCTTGTTGCCGTTGG-3’ ，下游引物：Chi-R：5’-CCCAAGCTTCTACTTTGCCGCCGGAAT-3’。

6.基于权利要求5所得几丁质酶CmChi6在酶解含胶体几丁质底物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用中酶解温度为45℃，pH值为7.4。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述酶解含胶体几丁质底物时还包括Ba²⁺。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述含胶体几丁质底物为几丁三糖、几丁四糖、几丁五糖或几丁六糖。