[发明专利]双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用

说明书

本发明公开一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用。利用本发明的引物对样品进行检测，可实现一次性同时特异性检测样本中的无乳链球菌和海豚链球菌。本发明建立的检测方法可检测到基因组含量分别为9.84×10^‑5ng/μL的无乳链球菌和9.30×10^‑5ng/μL的海豚链球菌，以及菌液浓度为2.76×10²cfu/mL的无乳链球菌和2.51×10²cfu/mL的海豚链球菌。本方法在罗非鱼样品检测过程中快速准确具有较高的特异性、灵敏度、重复性和稳定性，可实现罗非鱼链球菌病的早期分子预警，应用前景广阔，为罗非鱼链球菌病的快速诊断、流行病学调查等提供了准确而有效的手段。

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用。

背景技术

罗非鱼是世界范围内广泛养殖的水产品之一，据不完全统计，2014年，中国罗非鱼养殖产量达到169.85万吨，占全球养殖总产量的32％左右。近年来，罗非鱼链球菌病日益严重，已给罗非鱼养殖业造成严重的经济损失。研究表明罗非鱼链球菌病的主要致病菌是无乳链球菌和海豚链球菌，近几年危害最严重的是无乳链球菌病，无乳链球菌是一种人、畜和鱼共患的致病菌，其能感染海鲷、罗非鱼等多种海淡水鱼类发病，造成较高的死亡率。海豚链球菌同样是一种能引起鱼类发生感染和死亡的病原菌。海豚链球菌、无乳链球菌均能引起鱼类的败血症、脑膜炎等病症，从外部症状和两种病原菌的菌落、菌体形态上都很难准确判断是由哪一种链球菌引起的，这将严重影响到对病害的有效处理。

目前罗非鱼链球菌的常规诊断方法都很难满足对感染鱼样本快速诊断的要求，同时一些生理反应现象可能随外界环境的变化而改变，也极易导致误判情况的发生。普通PCR一次仅能检测1个基因，可能会造成漏检或误检。荧光抗体技术和ELISA费用昂贵且较需要熟练的技术操作；LAMP则存在假阳性现象；定量PCR则需要昂贵的仪器、专业的操作以及存在成本高等不足。因此，要达到对患病鱼的快速诊断，需要建立高度特异、敏感、快速的罗非鱼链球菌早期分子诊断技术。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物。

本发明的另一目的在于提供一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述引物或试剂盒的应用。

本发明的再一目的在于提供一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的方法。

本发明利用无乳链球菌和海豚链球菌的特异性鉴别基因，分别设计了特异性引物，采用双重PCR技术对两种链球菌进行快速检测。通过对双重PCR检测体系的优化，开发了针对无乳链球菌和海豚链球菌双重PCR检测技术的试剂盒，同时，建立了检测准确，高效的检测方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物，包括如下引物序列：

针对无乳链球菌16S rDNA基因的PCR引物：

P-1：5'-ATACCGCATAAGAGTGATT-3'；

P-2：5'-ACCACCTGTCACTTCTGCT-3'；

针对海豚链球菌Sip基因的PCR引物：

P-3：5'-TGAATAAGAAATTGTTTTTAGCG-3'；

P-4：5'-ACTTGTAATCGTTGGTTCTGCC-3'。

本发明提供一种双重PCR早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的试剂盒，包括上述引物P-1、P-2、P-3和P-4。