[发明专利]一种基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体的阻断ELISA的检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体的阻断ELISA的检测方法及其应用，本发明以PEDV N蛋白包被酶标板，纳米抗体BioNb2为阻断抗体，通过待检血清样品抑制纳米抗体BioNb2与PEDV N蛋白结合，以检测血清中猪流行性腹泻病毒特异性抗体；本发明的阻断ELISA方法能够排除抗原中的杂蛋白成分的干扰而具有良好的特异性，且操作简单，易于大范围推广，在猪流行性腹泻病毒的血清诊断方面具有良好的应用前景；本发明通过大量的实验优化阻断ELISA反应条件，使该方法用于猪流行性腹泻病毒抗体检测具有良好的重复性、特异性和灵敏性，与目前已有的商品化试剂盒相比，具有简便、快速、成本低廉等优势。

技术领域

本发明涉及免疫工程技术领域，更具体的说是涉及一种基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体的阻断ELISA的检测方法及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种猪易感的急性高度接触性传染性肠道疾病，其主要特征为严重的水样腹泻、呕吐、脱水、少食或不食、哺乳仔猪死亡率为100％。该病是目前危害养殖业最严重的疾病之一，每年给全球养猪业带来巨大的经济损失。PEDV能够感染各个年龄段的猪，成年猪主要表现为体重下降和营养不良等，但对一周龄以内的哺乳仔猪是致死性。该病于1791年首次发生于英国并在欧洲流行。我国是1973年首次在上海猪群检测到该病毒，随后一直以散在形式发生，直到2010年10月，PEDV高毒力变异毒株的出现并迅速传遍全国，引起PED在中国的全面爆发，导致100多万头哺乳仔猪的死亡，给中国养猪业带来几乎毁灭性的打击。PEDV属于冠状病毒科的冠状病毒属(Coronavirus)成员，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，PEDV的基因组长度约为28kb，编码至少7个开放阅读框，包括非结构蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3)和结构蛋白(核衣壳蛋白(N)，膜蛋白(M)，糖基化纤突蛋白(S)和包膜蛋白(E)。其中，PEDV N蛋白是一种与病毒复制、转录和组装相关的磷酸化的蛋白，在宿主免疫中具有重要的作用。已有研究报道，在PEDV感染早期，宿主能够产生高水平的抗N蛋白的抗体。此外，N蛋白高度保守，因此被认为是早期诊断和疫苗研发的靶蛋白之一。

过去几十年以来，大量检测PEDV的方法被报道。由于PED引起的临床症状与其他腹泻疾病的临床症状相似，比如传染性胃肠炎病，因此需要借助分子生物学和免疫学方法诊断该疾病。传统的PEDV诊断方法都是基于实验室检测的，包括病毒分离试验、反转录-聚合酶链式反应试验、间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验。然而，这些传统的方法耗时、昂贵，低特异性和低灵敏性且需要专业的设备及专业的操作人员。此外，样品间的交叉污染和运输延误都有可能造成结果判断不准确等问题。间接ELISA和竞争或阻断ELISA已被广泛应用于PEDV临床样品的检测，但这些方法是建立在PEDV特异性单克隆抗体或多克隆抗体的基础上的，具有费用昂贵、耗时、产量低和不稳定性等缺点。

抗体介导的免疫检测方法因其方便灵敏而被广泛应用。纳米抗体是一种天然缺失轻链和重链第一个恒定区的特殊IgG，它存在于骆驼科动物体内。与传统抗体的抗原结合片段不同，纳米抗体的抗原结合片段由一个单独的结构域构成，即重链抗体可变区(variabledomains of Camellidae heavy chain-only antibodies，VHH)，VHH分子量较小，约15kDa左右，是已知的最小的具有完整抗原结合功能的抗体片段。与传统的抗体相比，纳米抗体具有稳定性高，可溶性好、结合抗原能力强、亲和力强、免疫原性小和能在细菌体内大量表达等特点。因此，基于PEDV N蛋白特异性纳米抗体建立一种快速、灵敏、准确和低成本的诊断方法为临床监测宿主体内的抗体水平提供有力的工具，从而为养猪业的健康发展保驾护航，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容