[发明专利]一种高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌的选育方法及应用

说明书

本发明提供了一种快速高通量选育高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriu mglutamicumB1）及应用方法，以谷氨酸棒杆菌为对象，在30‑37℃，100‑200 r/min的摇床中培养一定时间后，经过常温常压等离子体（ARTP）诱变处理50‑180 s后，接种到0.05‑0.4 mg/mL浓度的磺胺胍培养基中30‑37℃培养1‑2天，经过培养后，利用氨基酸与茚三酮的特异性反应与相对应的菌株发酵上清液进行96孔板高通量筛选，可选育出高产菌株CorynebacteriumglutamicumB1。该菌株在100mL摇瓶发酵30‑48 h的条件下异亮氨酸产量较原始菌株提高了62.03%，且遗传性状稳定。该方法建立了磺胺胍标记初筛和茚三酮多孔板检测的高通量筛选策略，可以广泛应用于高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌高通量选育，提高筛选效率，具有巨大的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种高产氨基酸的高通量筛选方法，尤其是一种异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌高通量筛选方法，属于生物医药和大健康产业。

背景技术

L-异亮氨酸是人体八种必需氨基酸之一，同时又是三种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。因此，已被广泛应用于食品、动物饲料和医药等行业。L-异亮氨酸的生产方法主要有蛋白质水解法、化学合成法和生物发酵法。生物发酵法因其原料成本低、易于控制、节能环保成为工业化生产的首选方法。目前，国内异亮氨酸的产量还不高，生产技术相对国外还具有较大差距，高产菌株的选育成为异亮氨酸产量提高的重要环节。

常温常压等离子体(ARTP)诱变育种技术是由清华大学自主研发的一种微生物基因组快速突变技术。该技术具有成本低、操作简便、安全性高以及等离子体产生条件温和富含大量活性粒子、突变谱广、突变率高等优点，被广泛用于细菌、真菌、微藻等微生物的生物育种。

发明内容

针对上述问题，本发明使用ARTP诱变仪对谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)进行处理，然后通过添加适宜浓度的磺胺胍抗性标记初筛，再将初筛菌株接种至多孔板发酵培养后取上清液进行茚三酮显色反应检测，实现高通量筛选，在国内外还未见报道。

本技术发明目的是提供高产异亮氨酸的谷氨酸棒状杆菌，谷氨酸棒杆菌B1，保藏编号：CCTCC NO：M 2019118，分类命名Corynebacterium glutamicum B1，保藏日期：2019年3月1号，保藏地点：湖北，武汉，武汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。本发明建立了一套高通量筛选流程，高产菌株ARTP诱变筛选主要步骤：将原始菌株培养后，先进行ARTP诱变条件的优化，然后通过磺胺胍抗性标记进行初筛，挑选丰度饱满的菌落，接种到多孔板中培养，提取发酵上清液与茚三酮试剂在一定条件下反应，挑选出在OD₅₇₀下吸光值较大的菌株对应的发酵上清液^[7]，进行薄层层析法针对性对照检测，再经摇瓶复筛培养，提取上清液，利用氨基酸分析仪检测其异亮氨酸含量。具体高产异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌的选育方法，包括如下步骤，其流程见图1。

(1)以谷氨酸棒杆菌为对象，在30-37℃，100-200r/min的摇床中培养一段时间，再经过常温常压等离子体诱变处理30-180s；

(2)待诱变处理后接种到磺胺胍培养基中，在30-37℃培养1-2天；

(3)将步骤(2)得到的菌株利用茚三酮进行特异性显色反应后识别出优势菌株，将该优势菌株在种子培养基中培养后，再在发酵培养基中培养，进行氨基酸分析检测复筛后，筛选得到产量最高的菌株Corynebacterium glutamicumB1。

所述的常温常压等离子体诱变的辐射功率为100-120W，氦气流量为3-10L/min，诱变时间为 120-150s。

所述的磺胺胍培养基中含有0.05-0.4mg/mL的磺胺胍。