[发明专利]用于快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针及其检测方法

说明书

本发明发明了一种用于快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针及其检测方法，所述分子信标探针包括Beacon 1，Beacon2，Beacon3，Beacon4和Beacon5。本发明通过这5条探针全部覆盖对利福平耐药的rpoB基因的81个位点，从而检测利福平耐药的结核分枝杆菌。本发明中的分子信标探针检测灵敏度高，特异性强，能够快速特异地检测利福平耐药的结核分枝杆菌。本发明还公开了一种快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针的检测方法。

技术领域

本发明涉及一种快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针及其检测方法，属于结核分枝杆菌检测技术领域。

背景技术

结核病是一种古老的疾病，严重危害人类的健康及发展。虽然抗结核药物的发明及临床应用在控制结核中发挥了重要作用，但形势仍不理想。随着耐药结核的广泛出现，使结核病的防控形势日益严峻。根据世界卫生组织发布的《2018年全球结核病报告》，中国位于全球结核病高负担国家的第二位，每年大约有新发结核病患者90万人。耐药结核病仍然是一项公共卫生危机和卫生安全威胁。据世卫组织统计，2017年有55.8万利福平耐药新发病例。利福平作为结核病化疗的一线药物，在短期化疗中起重要作用，同时利福平耐药性的检测也是判断耐多药结核病的标志。传统的基于培养的药敏检测模式，用于实际临床诊断治疗受到很大限制。现已证实结核分枝杆菌耐利福平与RNA聚合酶的β亚基编码基因rpoB的突变有关，其中95％的突变都发生在rpoB上的507-533密码子(共81bp)利福平耐药决定区(rifampin resistance determining region，RRDR)上，通过检测RRDR区突变，就可以给出耐药信息。

现有检测结核分枝杆菌利福平耐药的技术主要有两大类：基于培养的药敏检测和基于核酸的分子生物学检测。基于培养的药敏检测的主要缺点是，耗时长，首先需要在分离培养的基础上进行结核分枝杆菌鉴定，此过程需要4-8周的时间，然后再此基础上进行后续的传统固体比例法(4-8周)或者液体药敏(1-2周)的时间，而且进行活菌操作，对人和环境不安全。而基于核酸的分子生物学检测为代表的有荧光定量PCR熔解曲线，其结果判读需要看熔解峰的峰型及Tm值，这加大了基层实验工作人员的难度，不易在基层推广使用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的分子信标探针及其检测方法。

技术方案

为达到上述发明目的，本发明提供了一种快速检测耐利福平的结核分枝杆菌的五条分子信标探针，其序列分别如下：

SEQ ID NO.1 5’-FAM-GCTACGGAGCCAATTCATGGACCAGACGTAGC-DAB-3’

SEQ ID NO.2 5’-HEX-CCACGGCGCTTGTGGGTCAACGTGG-DAB-3’

SEQ ID NO.3 5’-TEXRED-CCGACGCCGACAGCGGGTTGTTCGTCGG-DAB-3’

SEQ ID NO.4 5’-FAM-CGAGCTCAGCTGGCTGGTGCGCTCG-DAB-3’

SEQ ID NO.5 5’-TEXRED-CCTGCCGACTGTCGGCGCTG GCAGG-DAB-3’

本发明还提供了包含所述五种分子信标探针的耐利福平的结核分枝杆菌的实时荧光定量 PCR检测试剂，包括如下组分：

分子信标探针Beacon1，Beacon2，Beacon3，Beacon4和Beacon5，以及PCR扩增上游引物 rpoB-F和下游引物rpoB-R；

所述上游引物rpoB-F和下游引物rpoB-R的序列如下所示：

rpoB-F：5’-GGAGGC GATCACACCGCAGACGTT-3’