[发明专利]脂肪干细胞的分离与培养方法

说明书

本申请公开了脂肪干细胞的分离与培养方法。所述方法包括如下步骤：S1、收集脂肪组织；S2、在步骤S1得到的脂肪组织中加入胶原酶进行消化得到脂肪干细胞；S3、富集步骤S2得到脂肪干细胞；S4、对步骤S3得到的脂肪干细胞进行纯化和传代培养；其中，步骤S2中，所述胶原酶的氨基酸序列如Seq ID No.3所示；所述脂肪组织在所述消化的体系中的体积百分含量为40—60％；所述胶原酶在所述消化的体系中含量为0.20—0.30g/L；所述消化的时间为15—30min。本发明所述方法具有胶原酶用量少、脂肪干细胞分离效率高的优点，对脂肪干细胞的科学研究和大规模分离培养具有重要的价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及脂肪干细胞的分离与培养方法。

背景技术

因先天性畸形、创伤及肿瘤切除术等多种原因所造成的软组织缺损以及日益增多的整形美容需求，软组织填充是目前整形美容外科采用的一种常见技术。自体移植脂肪作为理想的软组织填充材料，其生物相容性优于人工组织替代用品、异体及异种材料，没有免疫排斥现象，同时具有取材容易、操作简单、充盈外形好等优点。然而，自体脂肪移植存在着术后脂肪存活率低(25％－80％)的问题极大地限制了其在临床中的广泛应用。近年来，随着对脂肪移植后存活机制的逐步了解，人们采取脂肪来源干细胞帮助移植脂肪有更高的存活率。研究报道表明，脂肪组织含有的原始成体干细胞占比很高，每克脂肪多达5000个脂肪干细胞，而每毫升骨髓只有100-1000个干细胞。与骨髓间充质干细胞相比，脂肪干细胞的获得更加方便，它们可以在局部麻醉下使用脂肪抽吸技术轻松得到。目前，脂肪干细胞使用的主要限速步骤是其提取、分离的技术。

胶原酶消化法是脂肪干细胞分离的主流方法。该方法与组织块贴壁法、吸附柱法、直接离心法和机械振荡法等其它方法相比，具有干细胞产量高的优点，但胶原酶的使用也提高了成本。根据胶原酶的使用类型、浓度和消化时间的不同，胶原酶浓度从0.75g/L至2.5g/L不等，消化时间从0.5h至3h不等。

胶原酶(Collagenase)是一种蛋白酶，一种肽链内切酶，能够在生理pH和温度条件下特异性识别高频率出现于胶原蛋白中的Pro-X-Gly-Pro序列，并切割该序列中性氨基酸(X)和甘氨酸(Gly)之间的肽键，而不损伤其它蛋白质和组织，是唯一一种可以降解具有三股超螺旋结构的天然胶原纤维的蛋白酶，这种胶原纤维广泛存在结缔组织内，降解脂肪组织中的胶原纤维对提高脂肪干细胞的数量十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供脂肪干细胞的分离与培养方法。所述方法具有胶原酶用量少、脂肪干细胞分离效率高等优点，对脂肪干细胞的科学研究和大规模分离培养具有重要的价值。

为达到以上目的，本发明提供的技术方案如下：

一种脂肪干细胞的分离与培养方法，包括如下步骤：

S1、收集脂肪组织；

S2、在步骤S1得到的脂肪组织中加入胶原酶进行消化得到脂肪干细胞；

S3、富集步骤S2得到脂肪干细胞；

S4、对步骤S3得到的脂肪干细胞进行纯化和传代培养；

其中，步骤S2中，所述胶原酶的氨基酸序列如Seq ID No.3所示；所述脂肪组织在所述消化的体系中的体积百分含量为40—60％；所述胶原酶在所述消化的体系中含量为0.20—0.30g/L；所述消化的时间为15—30min。

优选的，步骤S2中，所述脂肪组织在所述消化的体系中的体积百分含量为50％；所述胶原酶的在所述消化的体系中含量为0.25g/L；所述消化的时间为20min。

优选的，步骤S2中，所述消化的体系使用生理盐水作为溶剂；所述消化的环境条件如下：温度为35—38℃，优选37℃；转速为50—200rpm，优选100rpm。