[发明专利]一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法

说明书

本发明公开一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法，其特征在于：包括以芽孢杆菌作为宿主表达体系，利用芽孢杆菌胞外分泌能力实现灵杆菌非特异性核酸酶的高效表达；本发明重组表达出的灵杆菌非特异性核酸酶，比活力是目前商业化产品的3倍，本发明选用的芽孢杆菌分泌表达系统，从根本上解决了由其他表达系统自身特性所引入的内毒素及糖基化修饰等影响酶活或限制其应用的缺陷，高效的分泌型表达无需破碎细胞，纯化步骤更为简便，可以线性放大，便于规模性生产，值得推广。

技术领域

本发明涉及生物化学及分子生物学领域，尤其涉及一种基于芽孢杆菌表达系统高效表达灵杆菌非特异性核酸酶的方法。

背景技术

非特异性核酸酶是一类高活性水解酶，其最大的特性是能够非特异性降解几乎所有类型的核酸，且对核酸的序列没有严格的偏好性，其中来源于灵杆菌的非特异性核酸酶(extracellular Serratia marcescens nuclease，SMNE)，是一种分泌至胞外的糖非特异性核酸内切酶，对底物特异性要求较低，能够非特异性将一切形式的核酸降解为2-4个核苷酸，因此其最典型的用途主要是重组蛋白工程纯化上游工艺中核酸的去除，降低样本粘度便于后续处理，且对于包涵体的纯化同样有利，特别是微量分析时，如ELISA、二维凝胶电泳，可消除带点核酸对所分析的蛋白样品结果的影响，从而提高各研究手段的分析精度与效率。随着分子生物学的高速发展，通过基因工程菌株进行重组表达是高效且安全获得目的蛋白最广泛的方法，然而迄今为止，目前所使用的工程菌对SMNE进行重组表达都存在一些问题：

(一)以大肠杆菌表达体系时，具体为提取灵杆菌Serratia marcescens染色体DNA并制备DNA文库，根据灵杆菌基因组DNA序列设计引物，采用PCR方法扩增出非特异性胞外核酸酶的DNA片段，并通过该技术在基因的5’端引入6个组氨酸标签序列，之后将该基因构建于分泌表达载体pET-20b上，置于lac操纵子调控之下，转化进入大肠杆菌表达菌株，如BL21(DE3)，其后通过调整IPTG浓度诱导SMNE的重组表达，表达后的纯化步骤涉及镍基质的亲和层析、离子交换层析、疏水层析、反向层析、肝素琼脂糖亲和层和凝胶分子排阻等层析纯化过程；上述过程以大肠杆菌为表达宿主，通过构建适用于大肠杆菌的分泌表达载体，实现SMNE的胞外重组表达，这是由于SMNE非特异性切割核酸的特性，对于其表达宿主细胞是毒性蛋白，一旦表达即切割宿主细胞的核酸，造成宿主细胞的死亡，因此，需要严格控制其表达的操纵子来调控其基因的表达，而目前常用的乳糖操纵子，依靠IPTG诱导其进行表达，然而由于培养基中无可避免存在乳糖类似物，易引起目的蛋白的渗漏表达，对宿主大肠杆菌依然存在潜在的致死隐患，因此由大肠杆菌所引入的内毒素问题对后续纯化分离增加了操作上的难度，另一方面，由于大肠杆菌胞外蛋白分泌能力相较于其他原核生物始终较弱，表达出的蛋白容易受到该体系分泌能力的限制，分泌量低且在胞内快速以包涵体形式存在，降低了可溶性目的蛋白的获得，而对包涵体的纯化需经过反复的变性复性过程，操作繁琐且对目的蛋白的活性有一定影响；

(二)以毕赤酵母为表达宿主重组表达SMNE，具体根据灵杆菌基因组序列设计引物，采用PCR方法扩增出非特异性胞外核酸酶整套DNA片段，包括编码的信号肽、前导肽和成熟核酸酶序列，并通过该技术在成熟核酸酶的5’端引入6个组氨酸标签序列，之后将该基因构建于分泌表达载体pPIC3.5K上，置于AOX启动子调控之下，转化进入毕赤酵母表达菌株，其后通过调整甲醇浓度诱导SMNE的重组表达；表达后的纯化步骤涉及盐析、镍基质的亲和层析、离子交换层析、肝素琼脂糖亲和层和凝胶分子排阻等层析纯化过程，该方法毕赤酵母表达体系具有真核翻译后修饰系统，表达的目的核酸酶具有糖基化现象，从而影响了核酸酶的活性及其性质，此外，启动AOX需要以甲醇作为诱导剂，其中由于甲醇的挥发性使得诱导过程中不断需要补加，操作繁琐且对环境有一定影响，同时毕赤酵母虽然能够较快达到较高的细胞密度，但在分泌蛋白的过程中由于真核体系自身的翻译后修饰分选造成发酵时间过长，通常需要78h以上，大大增加了重组SMNE获得的周期。