[发明专利]肠道病毒D组68型VP1单克隆抗体的序列及其应用

说明书

本发明公开了一种肠道病毒D组68型VP1单克隆抗体的序列及其应用，利用提取EV‑D68病毒基因组RNA，通过反转录和PCR扩增得到VP1基因的cDNA，将其克隆到克隆载体，再转入表达载体得到重组表达质粒，转化宿主菌并用IPTG诱导蛋白表达，表达产物通过包涵体的提取、变性、纯化得到可以作为鉴别诊断抗原的VP1融合蛋白。利用重组VP1蛋白作为免疫原，免疫BALb/c小鼠取免疫小鼠脾脏并将其与骨髓瘤细胞SP2/0融合，获得了可表达VP1抗体的杂交瘤细胞株，此细胞能够稳定分泌单克隆抗体，通过流式细胞术来检测抗体的免疫原性。本发明同时获得了VP1单克隆抗体的H链、L链可变区核苷酸及氨基酸序列。

技术领域：本发明属于生物技术领域，涉及一种能特异性针对EVD68-VP1的单克隆抗体，具体涉及所述抗体的可变区序列和流式检测方法。

背景技术：肠道病毒D组68型(Enterovirus D68,EV-D68)属于小核糖核酸病毒科，最早于1962年在美国加利福利亚州的下呼吸道感染住院人的咽拭子样本中分离获得。EV-D68病毒感染所致的临床表现多样，从症状较轻的上呼吸道感染到严重的成人和儿童脑膜炎症状。研究表明，EV-D68在儿童中能引起急性迟缓性麻痹及脑神经功能性障碍。近年来，EV-D68病毒在中国及世界范围内均有流行。从2008年-2010年，EV-D68病毒在亚洲、欧洲、美国等地均有小范围流行。2014年12月，在全美47个州和哥伦比亚地区，有1152人被确诊为由EV-D68病毒引起的急性呼吸道感染。在我国，2014年8月，北京儿童医院的一个5岁女童被诊断为EV-D68病毒阳性，随后发展为严重的肺部感染。在中国，Xiang等人通过对2006年8月-2010年4月的6942例与急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infection，ARTI)相关的成年病人(年龄≥15岁)的鼻拭、咽拭样本检测发现，其中130例样本为肠道病毒感染样本，而感染的肠道病毒以CA21和EV-D68为主，EV-D68感染比例为10％，然而，此报道缺乏儿童ARTI的数据。LU等人对2009年-2012年间的41例儿童肠道病毒感染病例样本检测发现，EV-D68感染病例为7例，比例达17.1％。Xiao等人的另一项研究对中国2012-2014年重庆地区的1876个呼吸道感染的(Respiratory tract infections,RTD儿童的鼻拭子样本进行检测，发现19例EV-D68感染样本，其中13例样本是在2014年9月到10月检测出，并从样本中分离获得13株病毒，进化树分析发现这13株病毒与2014年的美国主要流行株具有高度同源性。目前，尚无针对EV-D68的有效抗病毒药物及预防性疫苗，所以对人群抗EV-D68抗体的血清学检测，以及研发有效的EV-D68治疗性药物、预防性疫苗是控制EV-D68病毒感染与流行的关键。肠道病毒D68型VP1基因，不仅可以作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，而且也可以依据VP1基因对小RNA病毒科内不同属进行分类。VP1是EV-D68的主要免疫显性衣壳蛋白，VP1基因全长927bp，含有病毒的主要抗原表位。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术的不足，制备一种针对EVD68-VP1的单克隆抗体，提供单克隆抗体的可变区核苷酸序列及氨基酸序列。并用流式细胞术对抗体进行检测。

本发明的技术方案为：

肠道病毒D组68型VP1单克隆抗体的可变区序列，所述的抗体包括重链可变结构域VH和轻链可变结构域VL；其中，重链可变结构域VH的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2；重链可变结构域VH依次包含高变区FRH1、CDRH1、FRH2、CDRH2、FRH3、CDRH3和FRH4，所述的核苷酸序列依次为SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、15，所述氨基酸序列依次为SEQ ID：4、6、8、10、12、14、16；轻链可变结构域VL的核苷酸序列为SEQ ID NO：17，氨基酸序列为SEQ ID NO：18；轻链可变结构域VL依次包含高变区FRL1、CDRL1、FRL2、CDRL2、FRL3、CDRL3和FRL4，所述的核苷酸序列依次为SEQ ID NO：19、21、23、25、27、29、31所述氨基酸序列依次为SEQ ID：20、22、24、26、28、30、32。