[发明专利]一种检测巨细胞病毒（HCMV）的RCA方法

权利要求书

1.一种检测巨细胞病毒(HCMV)的RCA方法，其特征在于，按照如下步骤完成：

(1)将待测标本按Qiagen公司的病毒DNA提取试剂盒步骤处理，获得含巨细胞病毒(HCMV)的基因组DNA样品；

(2)捕获探针的杂交：在反应管中依次加入含巨细胞病毒(HCMV)的基因组DNA样品、锁式探针、捕获探针，充分混匀，55±1℃水浴杂交，杂交完成后自然冷却至室温，加入溶于2×结合缓冲液的链霉亲和素包被的磁珠，混匀，室温放置，磁性分离，用1×结合缓冲液清洗磁珠数次，弃去洗液，得到杂交产物；

(3)锁式探针的环化连接与酶切：去离子水、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coliBuffer，轻轻混匀，在95±1℃下反应3-5min，然后再在45±1℃下孵育后，加入10×BSA缓冲液和E.coli DNA连接酶，混匀，在37±1℃进行环化连接反应；反应完成后加入10×Exonuclease Ⅰ Buffer和Exonuclease Ⅰ核酸外切酶，混匀，在37±1℃反应，反应完成后在95±1℃下条件下灭活ExonucleaseⅠ核酸外切酶，得到探针环化连接产物；

(4)RCA扩增：取步骤(3)中制得的探针环化连接产物、加入引物和10×phi29 Buffer，混匀后在95±1℃下反应3-5min，然后进行冰浴；再加入phi29 DNA聚合酶、dNTPs液，混匀后在37±1℃进行RCA反应，得到扩增产物；

(5)取步骤(4)制得的扩增产物用的琼脂糖凝胶电泳，有肉眼可见条带扩增出来的为巨细胞病毒(HCMV)阳性，反之为巨细胞病毒(HCMV)阴性，即可完成对巨细胞病毒(HCMV)的检测；

所述步骤(4)中所设计用于RCA反应的引物是：

5’-AACACTTATATATGATACCCATCTACGTTTCGTATTTCTAG-3’ SEQ NO1；

所述步骤(2)中的锁式探针为：

5’-CTAGATAAAAGCACGTTTTAGCGACCGATTAGCGACCGAATTCATTAGGGGAAGAAGACAGTTTCCCAACAGTTTTAAATTCTCCCACGACAGACACCGTCC-3’ 探针的5’端进行磷酸化修饰 SEQ NO2；

所述步骤(2)中的捕获探针为：

Biotin-AACACTTATATATGATACCACGGCCTATGACACCAATAACCATAAGA

SEQ NO3。

2.根据权利要求1所述的检测巨细胞病毒(HCMV)的RCA方法，其特征在于，步骤(2)中锁式探针、捕获探针的浓度均为0.5-1.5μmol/L，且锁式探针、捕获探针相对于DNA样品体积的10-20％。

3.根据权利要求1所述的检测巨细胞病毒(HCMV)的RCA方法，其特征在于，步骤(3)中10×E.coli Buffer相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25％；10×BSA缓冲液相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25％；E.coli DNA连接酶相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的1.5-2.5％；10×Exonuclease I Buffer相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25％；Exonuclease I相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25％。

4.根据权利要求1所述的检测巨细胞病毒(HCMV)的RCA方法，其特征在于，步骤(4)中引物的添加量为探针环化连接产物的1.8-3％；10×phi29 Buffer的添加量为探针环化连接产物的9.5-15％；phi29 DNA聚合酶的添加量为探针环化连接产物的1.8-3％。