[发明专利]一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法

权利要求书

1.一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法,该方法包括以下步骤：

通过垂直等电聚焦电泳将多种电荷异质体进行分离，对电泳后的凝胶进行固定并染色；

其中，等电聚焦电泳可通过以下方式实现：取适量重组人VEGFR-Fc融合蛋白，用超滤管超滤换液至一定量超纯水中；取适量超滤后样品与2×样品缓冲液等体积混匀后上样，所用凝胶为pH 3-10 IEF凝胶；电泳条件为100V电泳60min，200V电泳60min，500V电泳30min；

电泳完毕后，将凝胶用超纯水冲洗2遍，然后浸泡在12%三氯乙酸固定液中进行固定，室温振摇30min；

之后凝胶用超纯水清洗3遍后，加入适量考马斯亮蓝染色液，室温下振摇30min至条带明显、清晰；

再将凝胶放入超纯水中振摇，10min更换一次超纯水至凝胶背景无明显颜色；

（2）对分离后的多种电荷异质体条带编号，切割并收集到离心管中；

（3）将收集后的多个凝胶条带样品脱色，再进行还原和烷基化处理，最后使用胰蛋白酶进行胶内酶切；

具体步骤为：将收集后的凝胶条带使用50%乙腈的25mM碳酸氢胺的脱色溶液脱色，室温震荡30min进行脱色，重复脱色3-4次，至凝胶颜色脱至无色或很淡，吸出脱色液，加入乙腈，放置10min，吸出乙腈，并于冷冻浓缩离心机中干燥胶块；

加入10mM二硫苏糖醇的50mM碳酸氢铵溶液，于56℃水浴中30min，吸出二硫苏糖醇溶液，加入乙腈，放置10min，吸出乙腈，并于冷冻浓缩离心机中干燥胶块；然后加入含25mM碘乙酰胺的50mM碳酸氢铵溶液，室温避光反应45min，吸出碘乙酰胺溶液，加入乙腈，放置10min，吸出乙腈，并于冷冻浓缩离心机中干燥胶块；之后使用10μg/ml的胰蛋白酶的50mM碳酸氢铵溶液，其中胰蛋白酶与蛋白用量的质量比为1:40，于37℃水浴中酶切15h；

（4）酶切完毕后，对酶切后的肽段使用含1%甲酸的50%的乙腈溶液进行提取；

（5）对提取后的肽段进行UPLC-ESI-Q-TOF超高效液相串联质谱分析，确认多种翻译后修饰，所述UPLC-ESI-Q-TOF分析参数包括液相参数、质谱采集参数和样品分析参数如下：

液相参数：

质谱采集参数：

样品分析参数：

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2.一种糖蛋白多种电荷异构体翻译后修饰的评价方法,该方法包括以下步骤：

（1）通过垂直等电聚焦电泳将多种电荷异质体进行分离，对电泳后的凝胶进行固定并染色；

其中，等电聚焦电泳可通过以下方式实现：取适量重组人VEGFR-Fc融合蛋白，用超滤管超滤换液至一定量超纯水中；取适量超滤后样品与2×样品缓冲液等体积混匀后上样，所用凝胶为pH 3-10 IEF凝胶；电泳条件为100V电泳60min，200V电泳60min，500V电泳30min；

电泳完毕后，将凝胶用超纯水冲洗2遍，然后浸泡在12%三氯乙酸固定液中进行固定，室温振摇30min；

之后凝胶用超纯水清洗3遍后，加入适量考马斯亮蓝染色液，室温下振摇30min至条带明显、清晰；

再将凝胶放入超纯水中振摇，10min更换一次超纯水至凝胶背景无明显颜色；

（2）对分离后的多种电荷异质体条带编号，切割并收集到离心管中；

（3）将收集后的多个凝胶条带样品脱色，再进行还原和烷基化处理，最后使用胰蛋白酶进行胶内酶切；

具体步骤为：将收集后的凝胶条带使用50%乙腈的25mM碳酸氢胺的脱色溶液脱色，室温震荡30min进行脱色，重复脱色3-4次，至凝胶颜色脱至无色或很淡，吸出脱色液，加入乙腈，放置10min，吸出乙腈，并于冷冻浓缩离心机中干燥胶块；

加入2mM二硫苏糖醇的50mM碳酸氢铵溶液，于56℃水浴中30min，吸出二硫苏糖醇溶液，加入乙腈，放置10min，吸出乙腈，并于冷冻浓缩离心机中干燥胶块；然后加入含5mM碘乙酰胺的50mM碳酸氢铵溶液，室温避光反应45min，吸出碘乙酰胺溶液，加入乙腈，放置10min，吸出乙腈，并于冷冻浓缩离心机中干燥胶块；之后使用4μg/ml的胰蛋白酶的50mM碳酸氢铵溶液，其中胰蛋白酶与蛋白用量的质量比为1:100，于37℃水浴中酶切15h； （4）酶切完毕后，对酶切后的肽段使用含0.5%甲酸的50%的乙腈溶液进行提取；

（5）对提取后的肽段进行UPLC-ESI-Q-TOF超高效液相串联质谱分析，确认多种翻译后修饰，所述UPLC-ESI-Q-TOF分析参数包括液相参数、质谱采集参数和样品分析参数如下：

液相参数：

质谱采集参数：

样品分析参数：

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