[发明专利]一种制备纤维细胞作为细胞培养基的方法和用途

权利要求书

1.一种制备纤维细胞作为细胞培养基的方法，该方法包括以下步骤：

步骤1、提供胚胎干细胞悬浮液，培养为拟胚体(EB)并继续培养；

步骤2、培养到第6天后的将形成的EB接种到6孔板中，使用诱导培养基进行5天时间的培养，所述的诱导培养基的成分包括：DMEM+10％血小板裂解物(Platelet lysate)；

步骤3、当进行步骤(2)中的5天培养后，EB周围会爬出梭形的细胞，将梭形细胞挑出放于一个新的6孔板中用诱导培养基培养；

步骤4、当诱导培养的6孔板中的梭形细胞汇合度达到90％时，按1:3的比例传代，待细胞汇合度达到100％。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤4中，待细胞汇合度达到80％时，取一孔细胞用免疫荧光方法鉴定成纤维细胞特异性表面蛋白，鉴定细胞为成纤维细胞阳性后，其余的成纤维细胞继续培养，直到汇合度达到100％。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法进一步包括步骤5，在步骤4后，冷冻处理汇合度100％的成纤维细胞：吸去培养液，把6孔板密封后放入-20℃冰箱，24小时后取出。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，该方法进一步包括步骤6，在步骤5后，等-20℃冰箱冷冻处理24小时后，取出等每孔加入1ml DNA酶，37℃孵育5分钟，加入1mlPBS，冲洗掉附着在孔底部的成纤维细胞培养基，从而形成成纤维细胞的胞外基质培养基。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的诱导培养基包括DMEM和8-12％血小板裂解物(Platelet lysate)。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的诱导培养基包括：88％DMEM+10％血小板裂解物(Platelet lysate)+1mML左旋谷氨酰胺(glutamine)+100U/mL青霉素(penicillin)+100mg/mL链霉素(streptomycin)。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的诱导培养基为88％DMEM+10％血小板裂解物(Platelet lysate)+1mML左旋谷氨酰胺(glutamine)+100U/mL青霉素(penicillin)+100mg/mL链霉素(streptomycin)。

8.本发明提供根据前述权利要求1-8之一方法所获得的成纤细胞培养基在作为培养内皮细胞，周皮细胞，平滑肌细胞，成纤维细胞，口腔角质细胞，和皮肤角质细胞中的用途。