[发明专利]定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物

说明书

本发明公开了定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物。本发明提供的方法，包括如下步骤：1)、提取待测样品中细菌的基因组DNA和获得不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液；2)、用成套引物分别对稀释后不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液和待测样品中细菌的基因组DNA进行PCR扩增，再以稀释后标准品溶液的不同质粒DNA拷贝数的对数值为横坐标，不同质粒DNA拷贝数的标准品溶液的荧光定量PCR扩增反应初始循环数为纵坐标，建立标准曲线；计算待测样品中异化型亚硫酸盐还原酶基因拷贝数，即为待测样品中硫酸盐还原菌含量；本发明为一种检测快、成本低、特异性强、灵敏度高、可重复性好的广谱检测硫酸盐还原菌的方法。

技术领域

本发明涉及微生物检测鉴定技术领域，属于硫酸盐还原菌的快速分子检测领域，尤其涉及定量检测硫酸盐还原菌的方法及专用引物。

背景技术

硫酸盐还原菌是一类能够将硫酸盐异化成硫化物并且氧化各种生长底物的专性厌氧菌。在自然界中，但凡是厌氧的条件，都能拓生出硫酸盐还原菌的生态位，例如酸矿废水、蓝藻微生物垫、深海热液喷口、高盐微生物垫、海洋与淡水沉积物、海洋沉积物的沼气区、油田、厌氧净化植物、植物根系土壤、稻田等特定生态环境。

迄今为止，人们记载过的硫酸盐还原菌已超60个属中的220个品种。在油田中，最常见的硫酸盐还原菌是脱硫弧菌(Desultphovbrio)和脱硫肠状菌(Desulphfotomaculum)。

硫酸盐还原菌能够利用糖类、蛋白质、核酸和脂质几乎所有的降解产物，将硫酸盐离子最终变成H₂S等有毒的硫化物，进而导致周围环境的腐蚀和酸化，尤其是针对储油罐、油气井、输油管道、油轮和冷却塔等水环境。比如说，硫酸盐还原菌会寄生在储油罐中，尤其在注水时，会形成大量的H₂S，这会导致罐体酸化，进而引起腐蚀和脱离等安全问题。硫酸盐还原菌还能寄生在井身、输油管道等管体、存储容器中，类似地也会产生H₂S以及严重的侵蚀现象。硫酸盐还原菌会寄生于储油容器、输油管道、冷却塔里的其他微生物菌落中，形成H₂S和其他代谢产物，进而也能引起严重的腐蚀问题。

鉴于硫酸盐还原菌所引起的严重腐蚀现象，探寻一种可以灵敏、迅捷、广谱、可靠地在线定量监测工业操作环境中硫酸盐还原菌含量的方法，在实时分析腐蚀情况、及时采取防腐措施、延长设备使用期限、保障工业生产运行、保护水质生态环境等方面具有非常重要的意义。

在硫酸盐还原菌检测方面，目前使用的方法涉及以下4种类型：1)培养法，例如在液体培养基中检测硫酸盐还原菌的最大可能数法(国标方法)，其原理是利用硫化物与培养基中的亚铁离子反应生成黑色的硫化亚铁，根据测试瓶变黑的数目和待测样品的稀释倍数，查询数目表来得到样品中的硫酸盐还原菌的浓度。此方法虽有极高的准确性和极低的检出限，但耗时较久，只能检测出可培养的硫酸盐还原菌；2)基于特征化合物的检测方法，例如腺苷酰硫酸还原酶测定法，其原理是显色剂能够与待测样品细胞中裂解释放出的腺苷酰硫酸还原酶结合并产生蓝色响应，响应颜色的深浅与该酶的含量成正比关系，酶含量越高，产生的蓝色越深，最终通过比色卡读出硫酸盐还原菌的检测结果。此方法检测速度快，支持固体和半固体样品检测以及检测所有硫酸盐还原菌菌株(包含标准培养基无法培养的菌株)，但操作可重复性一般，有误差，需要对待测样品采取浓缩措施才能达到极低的检出限；3)基于细胞的检测方法，例如凝集反应检测法，其原理是细菌或者细胞等颗粒性抗原与抗体结合后，凝集成凝聚态颗粒，以出现凝集现象的最高稀释倍数推测待测样品中硫酸盐还原菌的数量。此方法特异性强，响应灵敏，检测迅速，但缺乏普适性抗体，且受主观影响较大，难以精确确定硫酸盐还原菌的数量；4)基于遗传物质的检测方法，例如聚合酶链式反应(PCR)检测法，其原理是根据硫酸盐还原菌特有的遗传标记物质(例如异化型亚硫酸盐还原酶基因序列)设计引物，通过检测扩增产物的琼脂糖凝胶电泳条带的亮度值来确定硫酸盐还原菌的含量。

发明内容

为了快速准确定量检测待测样品中硫酸盐还原菌含量，本发明提供了如下技术方案：