[发明专利]一种无痕化双靶点基因组编辑系统

说明书

本发明公开一种基于CRISPR/Cas9和λ‑Red的无痕化双靶点基因组编辑系统，其特征在于：1.pKS9分子量11,681kb，为温敏性质粒。含有基因：受四环素诱导的cas9和recX基因；受阿拉伯糖诱导的λ‑Red完整αβγ重组酶基因；抗性基因amp^r。2.pCSK分子量2,914 kb，含有两个用于特异性识别基因组的sgRNA插入位点；两个受鼠李糖诱导、用于自身质粒消除的间隔区gRNA序列；抗性基因kan^r。3.在同源臂27bp时，同时双点突变效率皆在92%以上；在同源臂40bp时，同时双基因的1kb替换效率在60%以上，当大片段基因替换和点突变同时进行时，各自的编辑效率不受影响。

技术领域

本发明属于基因组编辑技术领域，具体涉及一种基于细菌CRISPR/Cas9 II型免疫系统和λ-Red DNA重组系统相结合的高效、无痕化基因组编辑方法。

背景技术

CRISPR（Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats），可直译为成簇的、有规律的间隔短回文重复序列，是一种广泛存在于细菌和古生菌基因组中的高效基因剪切器，用于抵御外来遗传物质如噬菌体的侵入。在结构上，该系统由一个前导区(Leader)、多个高度保守的短重复序列区(Repeat)和存在于重复序列区间的多个间隔区(Spacer)所组成。前导区富含AT，长度为300～500bp的区域，一般位于CRISPR上游，被认为是CRISPR的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。间隔区长度为26～72bp，由俘获的外源DNA组成，其功能类似于免疫记忆，即用于细菌对含有该序列的外源DNA再次入侵时的识别，并通过Cas（CRISPR-associated）蛋白对其进行双链剪切。基于Cas蛋白基因序列的不同，CRISPR/Cas系统可分为多种，但只有Ⅱ型CRISPR/Cas9最为简单而被广泛应用。其作用原理是：在前导区的调控下，CRISPR区首先转录为长的pre-crRNA (Pre RISPR RNA)，并逐步加工为含有保守重复序列和间隔区的一系列成熟crRNA，同时进行转录的还有与crRNA重复序列互补的tracrRNA (Trans-activating crRNA)。当crRNA与tracrRNA转录出来后，二者互补配对而形成复合物，通过间隔区特异性识别靶基因序列，引导Cas9核酸内切酶在靶向位点进行双链DNA剪切。由于在细菌中几乎不存在非同源重组的修复功能，因此，该双链断裂将导致外源DNA的降解，从而达到对噬菌体等可识别入侵DNA的有效抵御。但如果此时存在有外源供体DNA片段（Donor）时，由于细菌具有同源重组修复机制而引发外源供体DNA片段与被剪切基因组之间发生同源重组，从而实现对基因组DNA的编辑。可见，CRISPR/Cas并没有基因重组活性，其功能只是造成基因组的双链断裂，因此更适合于基因重组工程中的选择压力或者反向筛选，即只有发生重组的阳性突变子才能保留。