[发明专利]定量检测抗虫蛋白Cry2A的酶联免疫试剂盒

说明书

本发明公开了一种定量检测转基因水稻中抗虫蛋白Cry2A的酶联免疫试剂盒及其检测方法。所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成。本发明的检测方法具有操作简便、能同时快速检测大批样品，具有高灵敏度、高特异性的特点。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及到一种定量检测转基因水稻中抗虫蛋白Cry2A的酶联免疫试剂盒及其检测方法。

背景技术

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在的革兰氏阳性菌，该菌分泌的抗虫晶体蛋白是目前主要的生物农药；分泌的抗虫蛋白按照氨基酸序列相似性被分为两类：Cry和Cryδ-内毒素。其中Cry蛋白对多种有害昆虫(如鳞翅目，双翅目，鞘翅目，线虫类和原生生物等)幼虫具有毒性。Cry毒素已经被转入多种农作物使其具有抗虫性。Cry2A蛋白是Cry毒素中的一种。目前转Cry基因的农作物主要有玉米、土豆、水稻、棉花等。

转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展。转基因食品虽然能够满足人们对产量、抗虫性等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了对转基因作物或者其衍生物中Cry2A蛋白进行快速的定量分析，研究开发Cry2A酶联免疫试剂盒具有非常大的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定量检测转基因水稻中抗虫蛋白Cry2A的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其具有操作简便、能同时快速检测大批样品，具有高灵敏度、高特异性的特点。

一种定量检测转基因水稻中抗虫蛋白Cry2A的酶联免疫试剂盒，所述酶联免疫试剂盒包括包被捕获抗体的微孔反应板，所述捕获抗体由保藏号为CGMCC No.16696的杂交瘤细胞株1D11-1A5分泌得到，或者由保藏号为CGMCC No.16695的杂交瘤细胞株2G4-1B8分泌得到。

所述试剂盒还包括样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴。

所述样品处理液的配方为：1M Tris,pH 7.5 500uL，1M NaCL 1.5mL，0.5M EDTA20uL，50％甘油2mL，10％SDS 1mL，用双蒸水配成10ML，使用时添加1片蛋白酶抑制剂以及50uL的1mM苯甲基磺酰氟；

所述生物素标记的检测抗体为100μg/mL生物素标记的Cry2A 2G4-1B8鼠单抗(PBS,50％甘油)溶液；

所述标准品为100ng的His-Cry2A重组蛋白；

所述辣根过氧化物酶标记的亲和素为1:40辣根过氧化物酶标记的亲和素溶液；

所述生物素标记的抗体稀释液以及辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方为1％BSA 1g，0.05％的吐温20 0.05mL，0.1％的NaN₃ 0.1mL，最终用1×PBS定容至100mL；

所述浓缩洗涤液为含有1.0％Tween-20的10×PBS；

所述底物溶液为0.5mL 2mg/mL TMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL 30％H₂O₂混合，现用现配；