[发明专利]一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法

说明书

本发明涉及一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法，所述纯化方法包括：对含有单克隆抗体的样品进行粗提纯；对所述粗提纯的产物进行透析；利用HPLC法对所述透析的产物进行纯化，其中，所述纯化采用阴离子交换介质，以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1～3ml/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温35～40℃，检测波长280nm；所述流动相A为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述流动相B为三羟甲基氨基甲烷缓冲液和氯化钠的混合溶液。本发明提供的单克隆抗体的纯化方法简单易行，蛋白回收率高、重复性好，适用于批量制备单克隆抗体。

技术领域

本发明涉及单克隆抗体纯化技术领域，尤其涉及一种方法简单、回收纯度高的单克隆抗体的纯化方法。

背景技术

单克隆抗体纯化是单克隆抗体研究和单克隆抗体药物制备过程中必须涉及和应用的基本技术。常见的单克隆抗体纯化通常是从细胞培养基中或者动物腹水中纯化药物级单克隆抗体蛋白质包括收获和净化，接着通过一系列的柱层析步骤或者膜超滤和渗滤结合而纯化。在纯化之后，期望的抗体制剂经适当配制并且存储在合适的条件中。然而，在柱层析纯化期间，有时可观察到工艺相关的和产物相关的杂质与期望的抗体一起共洗脱；同时，在各种柱层析联用技术中往往会出现溶剂置换等问题，不仅会打破蛋白在溶液中的稳态环境，还可能导致蛋白失活变性，也会无形中增加了纯化分析的难度与繁复程度，不利于商业化生产以及车间放大生产。因此，这种纯化过程相对复杂、回收率比较低，且无法提供具有其药物应用所需的期望水平的纯度和质量的抗体。

此外，现有的抗体纯化或者其他蛋白纯化过程中经常采用至少三种纯化技术(例如，亲和、离子交换、疏水相互作用等)相结合的方式使用来纯化样品，后期还要经过超滤/微滤等渗透方法结束工艺步骤，然而，多种纯化技术中的每一步纯化都会造成目的蛋白的流失，严重影响收率，尤其是药用领域的抗体类蛋白样品，由于本身稀少难得，再经过多步纯化就会导致所剩无几，还有可能因为繁复的操作而造成其他的不良影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法，该纯化方法分离效果好、回收纯度高。

为了达到上述目的，本发明提供一种简单高效的单克隆抗体的纯化方法，包括：对含有单克隆抗体的样品进行粗提纯；对所述粗提纯的产物进行透析；利用HPLC法对所述透析的产物进行纯化，其中，所述纯化采用阴离子交换介质，以流动相A和流动相B为洗脱液，流速为1～3mL/min，利用梯度洗脱模式进行洗脱，柱温35～40℃，检测波长280nm；所述流动相A为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述流动相B为三羟甲基氨基甲烷缓冲液和氯化钠的混合溶液。

进一步的，所述流动相A的pH值为6.5～8.5；所述流动相B的pH值为6.5～8.5。

进一步的，所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的终浓度为10～50mmol/L；所述氯化钠的终浓度为0.5～1mol/L。

进一步的，所述含有单克隆抗体的样品包括：含有单克隆抗体的小鼠腹水、含有单克隆抗体的杂交瘤细胞的培养上清、重组单克隆抗体的发酵上清。

进一步的，所述单克隆抗体包括：抗人CTGF单克隆抗体或抗人periostin单克隆抗体。

进一步的，所述阴离子交换介质是Q Sepharose FF系列、Capto Q系列、SOURCE Q系列、Propac-wax系列的阴离子交换凝胶。

进一步的，选用长度为20～30cm的色谱柱，填料粒径为2～10μm。

进一步的，对含有单克隆抗体的样品进行粗提纯的步骤包括：基于盐析法采用饱和硫酸铵溶液对含有单克隆抗体的样品进行盐析。

更进一步的，所述盐析法包括：于含有单克隆抗体的样品中先后加入饱和硫酸铵溶液至终浓度分别为体积百分浓度为40％～60％和30％～40％，分别于4℃盐析2小时，离心。