[发明专利]一种用于酶促化学发光检测的纳米酶及其用途

说明书

本发明提供一种模拟HRP酶活性的纳米酶，所述纳米酶为表面修饰有氯化血红素的铁基纳米材料。本发明还提供所述纳米酶的制备和使用方法及其用途。

技术领域

本发明属于纳米技术及免疫检测技术领域，具体涉及能够高效催化鲁米诺类化学发光底物的无机过氧化物模拟酶及纳米酶化学发光免疫检测技术及其应用。

背景技术

目前，免疫检测技术相关产品占体外诊断领域40％的市场份额，现行免疫检测技术主要包括：放射性免疫分析法(RIA)、胶体金免疫层析法、酶联免疫分析法(ELISA)、时间分辨荧光法(TRFIA)和化学发光免疫分析法(CLIA)。其中放射性免疫分析灵敏度较高，但需使用放射性同位素，易造成放射性污染；胶体金免疫层析法灵敏度较低，仅适用于即时定性检测；ELISA技术较为成熟、成本低，适用于批量样品半定量检测，但操作繁琐耗时，依赖于HRP酶稳定性；TRFIA灵敏度较高，特异性较好，但需激发光源，且试剂成本较高。而CLIA不仅具有灵敏度高、特异性好、线性范围宽、无需外接光源、背景干扰小等优异性能，且操作简便、易于实现自动化，适用于高通量筛查或急诊术前检查，是目前最先进的体外免疫诊断技术。现阶段CLIA已成为体外诊断最大的细分领域，其临床应用需求巨大，且保持15％的增速，逐渐替代ELISA检测，成为免疫诊断行业的主流技术。

CLIA从原理上结合了免疫反应和化学发光反应：一方面通过抗原抗体反应特异结合待测物质，另一方面利用化学发光物质或能够催化化学发光底物的酶标记检测抗体，在激发剂和发光底物存在下，促使发光物质形成不稳定的中间体，当由激发态返回至基态时释放出光子，蓝色光信号被化学发光仪采集；其中所结合待测物质的含量与化学发光强度呈正比，从而实现由光信号转换成待测物含量的定量分析[1]。根据固相载体的不同可分为板式化学发光和管式化学发光。板式化学发光检测，与ELISA类似，原料抗体包被及反应物结合在微孔板上；管式化学发光则采用超顺磁微粒作为固相载体，反应物结合于反应管中，外加磁场进行清洗。随着化学发光技术的不断演变迭代，根据发光底物和反应机理的不同，化学发光技术又可细分为：直接化学发光、酶促化学发光和电化学发光。直接化学发光包括：异鲁米诺和吖啶酯发光体系，第一代异鲁米诺直接化学发光试剂，由于性能不佳已被淘汰；吖啶酯直接化学发光为近年来新兴的第三代发光试剂，性能优异，发展迅速，但市场已被海外厂家(罗氏、雅培等)进口品牌所垄断。其中酶促化学发光主要分为：辣根过氧化物酶(HRP)-鲁米诺(Luminol)发光体系和碱性磷酸酶(ALP)-金刚烷(AMPPD)发光体系，以HRP-luminol发光体系最为常见，是我国体外诊断产业早期化学发光产品的主要形式，多用于肿瘤、传染病、激素、心血管疾病、肝功能、肾功能、代谢、药物浓度等项目检查[2]，后来逐渐被ALP酶促化学发光及直接化学发光产品挤占市场。第四代电化学发光技术灵敏度和准确度高，目前产品主要来源于进口厂家，如罗氏等，仪器及试剂多为封闭式系统，价格昂贵，应用推广有限。

由于化学发光技术壁垒高，研发难度较大，我国市场进口产品占比 80％以上；此外，由于化学发光试剂使用依赖于封闭式、高精密的自动化仪器，国内企业研发资金门槛高，试剂和仪器绑定销售，价格昂贵，因而国产化学发光产品在国内三甲医院等高端市场渗透率不高，临床应用缺口较大，基层检验普及率不高，尚有较大的发展空间。在当前的市场经济形势下，进口产品价格上调，国产替代迫在眉睫。进口化学发光产品以全自动管式直接化学发光为主，而国产化学发光品牌多集中在半自动板式酶促化学发光产品。方法学和发光底物的选择，决定了酶促化学发光产品在灵敏度和准确性方面受限。HRP-luminol发光系统逐渐暴露出较多缺陷：第一，核心原料HRP属于生物蛋白酶，对酸碱度、温度十分敏感，叠氮化物、氧化物、硫化物等均可抑制其活性，稳定性较差，影响化学发光检测的准确性和稳定性；第二，HRP最适催化pH值(pH5.0左右)与鲁米诺底物发光反应最适pH值(pH11～pH12.0)不匹配，碱性条件下并不能最大限度的催化鲁米诺化学发光，需使用增强剂以提高化学发光强度及灵敏度；第三，高纯度的HRP多源自于进口，价格昂贵，试剂成本较高。上述瓶颈严重制约了HRP酶促化学发光产品的推广应用。