[发明专利]一种protease nexin II\KPI蛋白突变体的应用

说明书

本发明涉及一种protease nexin II\KPI蛋白突变体及衍生物、类似物或其组成片段的应用，用于制备治疗与获得性血友病和有抑制物产生的血友病相关疾病或病症的药物。本发明可应用于出血性疾病药物的制备，特别是有抑制物的血友病的相关药物，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于出血病治疗领域，特别涉及一种protease nexin II\KPI蛋白突变体及其衍生物、类似物或其组成片段的应用。

背景技术

血友病A和B是由于凝血因子VIII(FVIII)或IX(FIX)缺陷所致遗传性出血性疾病,男性人群中发病率为1/5000和1/2000，患者临床上表现为凝血功能障碍，可出现自发性肌肉血肿和关节腔出血等。FVIII/FIX替代治疗是目前唯一有效的治疗手段。随着生物技术的发展，基因重组的FVIII/FIX，逐渐取代了血浆或者血浆来源的FVIII/FIX成为替代治疗的主要制剂。FVIII体内半衰期仅有不到12小时，FIX也仅有24小时左右，为了维持足够的血浆浓度以预防出血，患者每周需要注射2～3次，费用昂贵，据统计2011年美国等西方国家每年的FVIII制剂销售额超过52亿美元，预计2016年会超过70亿美元。虽然替代治疗可以有效预防和治疗FVIII/FIX缺陷所导致的出血，但是有30％的血友病患者会在治疗过程中产生抗FVIII抗体，少部分血友病B患者也会产生FIX抗体，导致替代治疗失效，不得不采用高剂量FVIII免疫诱导耐受治疗或应用包括活化的凝血因子VII(FVIIa)等在内的药物控制出血，治疗费用更加昂贵。欧美国家医疗保险部门每年需额外花费超过16亿美元以治疗产生FVIII/FIX抑制物的血友病患者。FVIII抗体的产生与FVIII制剂替代治疗中的剂量直接相关，儿童血友病患者首次替代治疗是因为手术、外伤等出血紧急状况下所进行的高剂量FVIII止血治疗时，FVIII抑制物产生的几率显著增加,剂量越高，治疗时程越长，FVIII抑制物越容易产生，当剂量高于35IU/Kg时抑制物产生的几率是小于35IU/Kg治疗组的2.4倍。血友病出血表现与血浆中的FVIII或FIX活性相关，然而，凝血因子活性水平相近的患者的出血严重程度仍然不同。有研究发现提出，促血栓形成的遗传危险因素与血友病共存可能会改善血友病患者的出血严重程度。凝血强度有凝血反应所产生的凝血酶的数量有关，凝血酶除了具有促凝功能外，还可以在内皮细胞上的血栓调节蛋白辅助下，将蛋白C转化为其活化形式的aPC。后者以蛋白质S为辅因子，催化裂解并灭活FVa和FVIIIa，限制凝血反应的范围和强度。除遗传性PC缺乏外，凝血因子V(FV)Leiden突变因为其对aPC的裂解所具有抵抗作用，都是血栓形成倾向的遗传危险因素。血友病患者同时存在FV Leiden或PC缺陷，出血表现较其他患者轻微。

protease nexin II\KPI是一种分子两位6,500Da的多肽分子，是protease nexinII蛋白的组成成分，表达于人体的多种组织中，例如神经细胞、血小板等。protease nexinII\KPI多肽链由57个氨基酸残基组成。protease nexin II\KPI蛋白的生理功能为特异性的活化的凝血因子XI的抑制物。protease nexin II\KPI与同为丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑肽酶在结构上同源。抑肽酶通过其对纤溶酶(Ki～1nM)和激肽释放酶(Ki～30～36nM)的高度特异性抑制活性来抑制纤维蛋白降解，同时抑肽酶也以相对较低的活性抑制其他蛋白酶，其对FXIa(1.1uM)和活化蛋白C(Ki～1.1～2.6uM)具有中等抑制活性但对FVIIa/TF复合物(Ki>10uM)，FXa(Ki>10uM)或凝血酶(Ki～27～61uM)几乎没有影响。抑肽酶在心脏手术中可显着降低出血量，减少此类手术中的输血需要。但是抑肽酶来源于动物组织(主要是牛肺脏)，可能产生过敏等不良反应，通过同源蛋白改造，将人体中protease nexin II\KPI中的氨基酸替换，使其酶抑制性改变，从而具有抑肽酶类似的促凝作用。protease nexin II\KPI突变体R15K/M17K和R15K/M17R对其生理抑制对象凝血因子XI的亲和力显著下降，由2nM升高为3081和707nM，但对纤溶酶的抑制活性由200nM降低至8nM左右，提示了其抗纤溶作用增强。同时，其对aPC的抑制作用也得以增强。