[发明专利]用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗，该减毒活疫苗的制备方法是构建质粒pSAG1::Cas9::U6sgNPT1和DHFR抗性片段，然后构建弓形虫RH:ΔNPT1虫株，以PBS作为溶剂在细胞培养基中制成弓形虫弱毒虫株RH:ΔNPT1的速殖子混悬液。本发明确立了该减毒活疫苗的免疫剂型，探明了其免疫接种程序及剂量，通过动物实验表明，本发明制备的减毒活疫苗对于急性弓形虫感染或慢性弓形虫感染均具有较强的免疫保护作用，可应用于急性弓形虫感染或慢性弓形虫感染的免疫保护，在弓形虫病防控方面具有巨大的应用价值。

技术领域

本发明属于弓形虫减毒活疫苗技术领域，尤其涉及一种用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的机会性致病原虫，可感染包括人在内的几乎所有的温血动物，在世界范围内广泛分布。弓形虫专门寄生在有核细胞内，其中间宿主普遍而且无特异性，其感染可引起宿主严重的脑病、眼病、流产、死胎等，严重危害人类的健康，并给畜牧业造成巨大的经济损失。弓形虫在中间宿主体内存在速殖子和缓殖子2种形态，现有药物的治疗仅对虫体的速殖子时期起作用，对于包囊内的缓殖子收效甚微，且药物的使用存在一定的毒副作用。

近年来，有学者指出开发疫苗免疫宿主可能是防控弓形虫病的有效措施，但目前尚无有效疫苗可用于弓形虫病的防控，其关键原因在于未寻找到合适的靶标基因。因此，寻找新型有效的疫苗候选抗原进行抗弓形虫病疫苗研发成为防护人类健康的重要任务。目前，弓形虫病疫苗的研发主要集中在灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗等，但此类疫苗仅能为免疫机体提供部分免疫保护力，而无法达到完全保护的程度，免疫保护效果并不理想。弱毒疫苗因具有免疫原性好、免疫期长等优点，成为弓形虫病防控的最佳选择之一，但目前仅有一株S48弓形虫弱毒活疫苗被允许在预防山羊和绵羊的流产中应用，应用局限性大，因此加快抗弓形虫病弱毒疫苗的研发具有极为重要的意义。

发明内容

针对上述背景技术中指出的现有技术的不足，本发明提供了一种用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗及其制备方法，所制备的减毒活疫苗能够有效抵抗弓形虫的急性感染和慢性感染，可用于预防弓形虫病。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗，该减毒活疫苗是以PBS作为溶剂制成的弓形虫弱毒虫株RH:ΔNPT1的速殖子混悬液。

上述用于预防弓形虫感染的RH:ΔNPT1减毒活疫苗的制备方法如下：

(1)敲除质粒的构建

根据弓形虫NPT1基因设计sgRNA：GATGAAGGTGCAAGCTCCCG，然后将pSAG1::Cas9::U6sgUPRT中的sgRNA替换成NTP1，即构建质粒pSAG1::Cas9::U6sgNPT1；从质粒pUPRT-DHFR-D扩增获得DHFR抗性片段；

(2)弓形虫RH:ΔNPT1虫株的构建

培养速殖子用于弓形虫的电转染，将所述质粒pSAG1::Cas9::U6sgNPT1与DHFR抗性片段电转到弓形虫中，获得弓形虫单克隆虫株，放大培养后，提取基因组DNA，验证NPT1基因是否敲掉，PCR扩不出来者为阳性RH:ΔNPT1虫株；

(3)减毒活疫苗的制备

含FBS的DMEM培养基中加入100μLRH:ΔNPT1虫株，培养并收集RH:ΔNPT1速殖子，过滤细胞碎片，然后用无菌PBS调整速殖子的浓度。

优选地，所述DHFR抗性片段扩增的引物为：

DHFR-F：AAGCTTCGCCAGGCTGTAAA；