[发明专利]德国小蠊钠离子通道抗性突变基因、蛋白及扩增引物、鉴定引物和鉴定方法

说明书

本发明公开了德国小蠊钠离子通道抗性突变基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。并公开了其蛋白及扩增引物、鉴定引物和鉴定方法。本发明以一对引物扩增德国小蠊相关抗性基因突变的基因片段并进行测序，通过四引物ARMS‑PCR法鉴定德国小蠊抗性基因。本发明可以广泛应用于德国小蠊抗性基因突变的鉴定需求及相应的科研领域。

技术领域

本发明涉及一种德国小蠊钠离子通道抗性突变基因、蛋白及扩增引物、鉴定引物和鉴定方法，属于生物技术领域。

背景技术

德国小蠊是一种常见的全球性家居卫生害虫，喜欢在潮湿，温暖条件下栖息，但是也能够抵抗干燥的环境。随着人类的交通活动而在世界范围内都有广泛的分布。在适宜条件下,一只雌虫一年可繁殖4代左右。德国小蠊强大的繁殖能力使其能够迅速成为当地的优势室内种群。作为一种杂食性物种，几近一切物品都可能变为它恰当的食源，无论是糖类，淀粉，肉类，还是纺织品，腐败的物品，食物饮料残渣，体液毛发等都是德国小蠊的食物。除了能够损坏食品、家具、纺织衣物、纸张外，其自身还能携带多种致病菌，如：伤寒杆菌、痢疾杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、霉菌病毒和寄生虫卵等多种病原微生物，从而造成各种传染病的流行。当人类接触其污染过的食品等物品后，还可能造成人体感染过敏、诱发哮喘和过敏性鼻炎等。为了减小德国小蠊给人们生活工作所带来的影响与危害，长期以来多采用各类化学杀虫剂对其进行杀灭，然而由于杀虫剂的频繁使用和各种滥用，再者德国小蠊繁殖速度较快，久之，德国小蠊对各种常用杀虫剂产生了不同程度的抗性。

针对德国小蠊的抗性机理研究表明，其抗药性主要可分为四类，行为抗性、表皮穿透速率降低、靶标抗性和代谢抗性。靶标抗性，是由于昆虫的钠离子通道基因点突变造成的，且与抗性表型连锁，因此监测突变基因的频率可以监测抗性表型。本实验在进行德国小蠊的抗性监测时，从钠离子通道基因中筛选到一个新型的突变位点，其1058位密码子由TCC突变为CCC，导致该位点氨基酸由丝氨酸改变为脯氨酸。本实验提供一种针对该抗性突变的四引物ARMS-PCR检测技术，ARMS-PCR全称扩增抗拒突变系统PCR，其原理是利用引物3’末端碱基互补性来控制引物的延伸，针对该突变位点设计一对3’末端对应不同基因型且延伸方向相对的内引物，同时在突变位点外部再设计一对外引物，将突变位点和内引物对包含在内。在PCR扩增反应中按比例加入外引物对和内引物对，即可根据扩增片段的琼脂糖凝胶电泳结果可直接判断突变位点的有无与突变状态。

发明内容

1、发明目的。

本发明提出了一种德国小蠊钠离子通道抗性新型突变基因和蛋白的序列，设计了测序扩增引物，并建立了一种针对该位点的突变鉴定方法。

2、本发明所采用的技术方案。

一种德国小蠊钠离子通道抗性突变基因，其第1058位密码子由TCC突变为CCC。

优选的，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

一种德国小蠊钠离子通道抗性突变蛋白，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

通过测序比对发现德国小蠊钠离子通道氨基酸改变为S1058P，丝氨酸改变为脯氨酸,对应的碱基突变为TCC→CCC。

本发明还公开了上述德国小蠊钠离子通道抗性新型突变基因的测序扩增引物，包括：

5′端随机引物：BgF2 5′-TTGCACAATTTTCTGTTTGGATA-3′

3′端锚定引物:BgR 3′-TCTGATCGGATATCTGATTGGTTA-5′。

以及德国小蠊钠离子通道抗性突变基因的鉴定引物，包括如下四个引物：

OP1:5′-AGCAACTTTGGTTCATCCAATCT-3′

IP1:5′-GTGCCAAATTAACCAATCAGATATCC-3′