[发明专利]一种提取超长环状DNA的方法

说明书

本发明针对长片段DNA提取过程存在的DNA易水解、质量差、数量少、成本高的问题，提供一种提取超长环状DNA的方法，属于分子细胞生物学领域。包括以下步骤：将转化的细菌初始培养并制作克隆平盘，从过夜培养的平盘中挑取克隆并植入含有相应抗生素的培养液中，培养至生长平台前期；将培养液转移至离心管中离心去上清，收集细菌沉淀，再经过TE缓冲液悬浮、离心，彻底弃去上清；加入蔗糖TE缓冲液后，加热至98℃，2‑3分钟后迅速冷却；以转速21K x g离心10分钟后，小心收取上清于新试管内，向新试管内加入预冷的异丙醇和醋酸钠，离心后沉淀出初期DNA收获物，用70％乙醇洗去盐分和杂质后室温晾干。本发明操作简便，成本低，环境友好，可获取大量、超长的高质量DNA。

技术领域

本发明属于分子生物学和分子遗传学及细胞生物学领域，具体涉及一种提取超长环状DNA的方法。

背景技术

随着分子生物学和细胞遗传学技术的迅速发展，不同生物物种的DNA测序、克隆、功能分析及鉴定技术已经得到广泛深入的应用。但针对长片断环状DNA，特别是超长质粒、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，简称BAC)克隆DNA的扩增和纯化步骤一直是一个重复率高、效率低下、劳力密集的过程。纯化过程常常应用到昂贵的纯化柱或者磁珠，效费比很低且失败率很高。BAC是基于大肠杆菌F因子质粒的克隆载体，能够插入DNA的片段高达300kb，为有效研究基因功能提供了强有力的工具。但BAC克隆DNA的制备过程一直相当具有挑战性，成功率在很大程度上取决于实验能获取的DNA纯度和数量。虽然人们已经开发了一些方法来分离和纯化BAC重组体，但这些纯化方法与从高拷贝数的质粒中提取DNA是完全不同的，直接从菌落和培养物中提取BAC DNA是极为低效的。因为现有的方法在裂解大肠杆菌细胞的同时，既释放出了BAC DNA，也释放了细菌染色体DNA，造成最终产物的污染。传统中使用的提取试剂盒试剂中往往含有高浓度的有机溶剂和难以去除的盐分，对最终产物形成一定程度的污染。而纯化柱对于分离大于50kb以上的双链DNA有相当的难度。此外，BAC是以单拷贝的形式存在于宿主细胞中，拷贝数远低于其他质粒。产量不足与纯度不够是超长DNA提取的主要瓶颈。超长质粒或BAC克隆技术，或者独立的超长DNA扩增纯化技术，由于不可或缺的应用要求，特别在基因组与染色体分析的相关的分析实验中，发明一种稳定好、操作简洁、效费比高的扩增与纯化技术，或基于此技术的应用试剂盒，是亟需解决的一个问题。

发明内容

本发明的目的在于克服上述长片段DNA提取过程存在的DNA易水解、质量差、数量少、易污染、成本高的问题，提供一种提取超长环状DNA的方法，该方法能够从小体积细菌培养液中获取质量高、数量充分超长的DNA，并且操作简易，成本低、环境友好。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种提取超长环状DNA的方法，包括以下步骤：

(1)将转化的细菌初始培养并制作克隆平盘，从过夜培养的平盘中挑取克隆并植入含有相应抗生素的培养液中，培养至生长平台前期；

(2)将培养液转移至离心管中离心去上清，收集细菌沉淀，细菌沉淀再经过TE缓冲液悬浮、离心，彻底弃去上清；

(3)加入蔗糖TE缓冲液后，加热至98℃，2-3分钟后迅速冷却；

(4)以转速21K x g离心10分钟后，小心收取上清于新试管内，向新试管内加入预冷的异丙醇和醋酸钠，离心后沉淀出初期DNA收获物，用70％乙醇洗去盐分和杂质后室温晾干。

本发明的技术核心是通过增加细菌细胞壁的渗透压差、物理改变细胞壁结构与抑制菌体内源性或外源性DNA酶活性的方法获取超长DNA。蔗糖的作用是改变细胞壁内外渗透压，TE缓冲液是为了保护DNA被水解。物理加热大肠杆菌是为了增加细菌内压力，增大细菌壁的孔径，使蛋白变性特别是附着于载体DNA的蛋白变性，改变载体DNA结构，有利于载体DNA释放到缓冲液中，同时，尽量保持细菌自身染色体留在细菌内，避免污染载体DNA。