[发明专利]一种介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法

说明书

本发明涉及一种介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，属于基因工程技术领域。该方法首先提取中华紫胶虫总RNA并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增产物和L4440载体经SacI和SalI双酶切，酶切产物利用T4连接酶连接过夜，得到的FAD‑L4440重组质粒转入到HT115感受态细胞中，扩大培养至菌液OD₆₀₀为0.1~0.7，加入IPTG诱导2~5h，得到FAD‑L4440‑HT115菌体，将菌体稀释后直接涂抹在中华紫胶虫幼虫期虫体上。本发明方法能将dsRNA转染到紫胶虫体内，有效干扰FAD基因表达量，从而引起个体泌胶量降低，为RNAi转染过程中不适用注射法、喂食等转染方法的昆虫提供参考。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法。

背景技术

中华紫胶虫（Kerria chinensis）隶属于半翅目（Hemiptera）、胶蚧科（Tachardiidae）、胶蚧属（Kerria），是一种具有重要经济价值的资源昆虫，主要寄生于交趾黄檀（Dalbergia cocrinchinensis）、光叶合欢（Aibizia lucida）等植物上，通过吸取植物韧皮部的汁液生长繁殖。紫胶是雌虫通过腺体分泌出的一种纯天然的树脂，主要成分由紫胶树脂、紫胶蜡、紫胶色酸等组成。紫胶具有粘接性强、绝缘性好、防潮、涂膜光滑等优良特征，而且无毒、无味等优良的物化性能而被广泛应用于军工、日用化工、电子等行业，具有重要的经济价值。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在真核生物中，由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发同源mRNA降解，使靶基因表达沉默的现象。dsRNA转染有注射、喂食、浸泡、病毒感染和转基因等方法，较常用的是注射法和喂食法。在RNA干扰研究的初期，注射最初主要应用于线虫，并随着在果蝇中运用的开展，目前已在小菜蛾（Plutella xyllostella）、褐飞虱、（Nilaparvata lugens）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）等研究对象中建立了注射dsRNA诱导RNAi的体系。但当研究对象个体过小时，注射难度增大且成活率降低这一问题仍无法得到有效解决。喂食法诱导RNAi因其操作简单方便，对研究对象危害性小等特点已在马铃薯甲虫（Leptinotarsa decemlineata）、麦长管蚜（Sitobion avenae）等昆虫中得到应用。但喂食法存在作用较慢、效率较低的缺点。由于注射法和喂食法各自存在缺点，在研究对象个体过小且不能喂食时，使用哪种转染方法将dsRNA转染到昆虫体内显得至关重要。

本研究的虫种中华紫胶虫个体较小，且是刺吸式口器，口针刺入寄主植物后便终身不动，通过吸取植物的汁液生长繁殖。因而紫胶虫选择哪种转染方式对使用RNAi验证相关基因功能至关重要。因此如何克服现有技术的不足是目前基因工程技术领域急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，该方法能将dsRNA转染到紫胶虫体内，为RNAi转染过程中不适用注射法、喂食等转染方法的昆虫提供参考。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种介导双链RNA进入中华紫胶虫体内的方法，包括如下步骤：

步骤（1），提取中华紫胶虫总RNA并反转录为cDNA后进行PCR扩增，扩增产物和L4440载体经SacI和SalI双酶切，酶切产物利用T4连接酶连接过夜，得到FAD-L4440重组质粒；