[发明专利]一种血浆cfDNA全局性甲基化检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种血浆cfDNA全局性甲基化检测方法及应用，涉及生物检测技术领域，其中，所述血浆cfDNA全局性甲基化检测方法为在从血浆中提取出的少量cfDNA中补加甲基化且含有生物素标记的外源DNA(λDNA)，然后进行富集甲基化实验，将收集的产物通过PCR扩增后，再基于生物素‑链霉亲和素反应、采用链霉亲和素磁珠去除带有生物素标记的λDNA，得到cfDNA扩增文库，并进行高通量测序。本发明适用于少量的血浆cfDNA甲基化分析，无需特定地商品化试剂盒，操作简便高效，减少了样品的损失、提高了建库效率、且极大地提高了MeDIP等富集甲基化实验方法地检测灵敏性，具有较广泛的适用性。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种血浆cfDNA全局性甲基化检测方法及应用。

背景技术

血浆游离DNA(cfDNA)是细胞释放到外周血中的游离DNA，在肿瘤细胞中发生的一系列分子变化，如甲基化修饰状态、序列突变、核小体占位等都能从肿瘤中释放到血液中的cfDNA中反映出。因此，cfDNA被大量研究以期作为一种癌症检测的预后或预测标志物。与DNA突变相比，DNA甲基化稳定性更强、可以持续测量，因为它往往发生在DNA上被称为CpG岛的的特定区域；而基因突变的多样性决定了为了进行癌症诊断需要对很大比例的基因组进行检测，以完成足够灵敏度的测试。因此，cfDNA甲基化的检测作为一种非侵入性的液体活检技术，在肿瘤早期检测、药物筛选和预后评估等临床诊治中具有广泛的应用价值。

但血浆中cfDNA数量少、片段短，尤其是早期肿瘤释放的cfDNA有限，而现有的全基因组水平甲基化检测技术往往需要较多的起始DNA。MeDIP-seq作为一种成本相对较低，应用广泛的甲基化检测方法，经常被用来进行临床样品甲基化组的研究，但是通常需要的样品DNA量较大(起始量几百纳克甚至几微克)，目前通过MeDIP-seq方法检测血浆cfDNA甲基化所需的最低DNA量为50ng，若以全血为出发样品，则至少需要自10～20mL全血中分离至少5mL血浆进行cfDNA的提取，所需样本量大，不利于临床多次取样和保存，限制了cfDNA甲基化检测在肿瘤诊断、药物筛选和预后监测等领域的应用。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种检测微量cfDNA的全基因组甲基化技术。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是降低所需样品起始量，实现对微量血浆cfDNA(5ng DNA)的DNA甲基化分析，建立一种通用型的血浆cfDNA全局性甲基化无创检测标志物筛选的技术，提高血浆cfDNA甲基化检测在肿瘤液体活检领域的应用价值。

为实现上述目的，本发明提供了一种血浆cfDNA全局性甲基化检测方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1、从血浆中提取出cfDNA；

步骤2、在所述步骤1中得到的所述cfDNA中补加甲基化且含有生物素标记的λDNA；

步骤3、进行富集甲基化实验，并将收集的产物通过PCR扩增后，基于生物素-链霉亲和素反应、采用链霉亲和素磁珠去除所述产物中带有生物素标记的λDNA，得到cfDNA扩增文库；

步骤4、将所述步骤3得到的所述cfDNA扩增文库进行高通量测序。

进一步地，所述步骤1和步骤2之间还需进行cfDNA原始文库的构建，包括以下步骤：

S1、将cfDNA进行末端修复；

S2、在cfDNA 3’末端添加A碱基；

S3、将经过所述S1、S2步骤处理的cfDNA两端连接测序接头引物，得到连接产物；

S4、将所述S3中得到的所述连接产物进行琼脂糖胶电泳分离并回收200-500bp范围内的所述连接产物，得到纯化的cfDNA原始文库。