[发明专利]银杏内生真菌代谢产物及在制备抑菌剂中的应用

说明书

本发明公开了一种银杏内生真菌代谢产物及在制备抑菌剂中的应用，所述代谢产物由黄盖小脆柄菇(Psathyrella candolleana)Gb.PY‑F1发酵液经超声、微滤、硅胶柱层析、凝胶Sephadex LH‑20柱分离、半制备液相分离制备得到。所述银杏内生真菌代谢产物对金黄色葡萄球菌MIC＝6.25mg/mL。天然成分的抑菌剂，安全性高。

(一)技术领域

本发明涉及一种金黄色葡萄球菌抑菌剂，具体涉及一种内生真菌代谢产物及在制备抗金黄色葡萄球菌药物的应用。

(二)背景技术

植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，包括内生真菌和内生细菌。近年来，国内陆续报道了从多种药用植物中已分离获得了产生多种药理活性物质的内生菌。银杏作为一种古老的药用植物，素有“活化石”之称，其具有抗肿瘤、抑菌等多种药理活性。目前，银杏等其他物种资源都非常匮乏，如果大量地采伐又涉及到生态和环境等领域的问题。因此，寻找一种可以高效低耗地开发利用天然药物的方法日益重要药用植物内生菌也因此成为研究热点。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种银杏内生真菌代谢产物及在制备抑菌剂中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种银杏内生真菌代谢产物，所述代谢产物按如下方法制备：(1)将黄盖小脆柄菇(Psathyrella candolleana)Gb.PY-F1发酵液经超声破碎后抽滤，滤液经微孔滤膜过滤后用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至干，获得代谢粗产物；所述黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2019125，保藏日期为2019年3月6日，地址为中国武汉武汉大学，邮编430072；(2)将步骤(1)代谢粗产物用乙酸乙酯溶解后进行硅胶柱层析，以体积比100→0:0→100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比0:100石油醚-乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为样品Gf.11；(3)将步骤(2)样品Gf.11用乙酸乙酯溶解后再次进行硅胶柱层析，以体积比60:1→0:1的氯甲烷-甲醇为流动相梯度洗脱，收集体积比5:1氯甲烷-甲醇的流出液，浓缩至干，记为组分Gf.11-8；(4)组分Gf.11-8以体积比1:1的二氯甲烷：甲醇为洗脱剂进行凝胶Sephadex LH-20柱分离，收集第1至第4个柱体积的流出液，浓缩至0.05倍体积，获得浓缩液；(5)将步骤(4)浓缩液用半制备液相分离，以体积比80:20的乙腈：水为流动相，流速为3mL/min，收集第3-4分钟所出的单峰，浓缩至干燥，得银杏内生真菌代谢产物。

进一步，步骤(1)发酵液制备方法为：将黄盖小脆柄菇(Psathyrellacandolleana)Gb.PY-F1接种于发酵培养基中，28℃，180r/min培养7d，获得发酵液；所述发酵培养基组成：硝酸钠3g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蔗糖30g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.0～7.2。

进一步，步骤(1)代谢粗产物制备方法为：在405W条件下，每工作3s，间歇4s，进行300次循环对发酵液进超声破壁处理后抽滤，取滤液经0.45μm微孔滤膜过滤后浓缩至原体积的1/3，用乙酸乙酯萃取，有机相浓缩至恒重，获得黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1代谢粗产物。

进一步，步骤(2)按如下操作进行：将步骤(1)黄盖小脆柄菇Gb.PY-F1代谢粗产物用乙酸乙酯溶解，加入硅胶，研磨均匀后，真空干燥，即为吸附样品的硅胶；将吸附样品的硅胶上样于硅胶色谱柱中，装柱量3/4，采用体积比100→0:0→100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集体积比0:100石油醚-乙酸乙酯的流出液，浓缩至干，记为样品Gf.11；所述硅胶与代谢粗产物质量比为1.5：1。

进一步，步骤(2)石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱体积比依次为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100。