[发明专利]一种加载PD-1抗体的T细胞体外培养方法、其细胞制剂及其应用

权利要求书

1.一种T细胞的培养方法，其特征在于，包括：对外周血单个核细胞进行培养，并在培养后期向培养液中添加PD-1抗体继续培养；

所述培养方法包括以下步骤：其包括将外周血单个核细胞与A抗培养基混合进行第一次培养；然后，将第一次培养得到的产物与B型培养基混合进行第二次培养；最后，将第二次培养后得到的产物与K型培养基混合进行第三次培养；

所述A抗培养基由以下组分组成：完全培养基、CD3单抗、白介素-2、维生素B6、干扰素-γ、白介素-1b、白介素-4、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；在A抗培养基中，CD3单抗的终浓度为80～120ng/ml；白介素-2的终浓度为800～1200u/ml，维生素B6的终浓度为5～15ng/ml，干扰素-γ的终浓度为15～25ng/ml，白介素-1b的终浓度为5～15ng/ml，白介素-4的终浓度为5～1ng/ml，L-谷氨酰胺的终浓度为180～220ng/ml,丙铜酸钠的终浓度为15～25ng/ml，血浆蛋白的终浓度为40～60ng/ml；

所述K型培养基由以下组分组成：完全培养基、PD-1抗体、白介素-2、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；在K型培养基中，PD-1抗体的终浓度为5～15ng/ml；白介素-2的终浓度为1800～2200u/ml，L-谷氨酰胺的终浓度为40～60ng/ml,丙铜酸钠的终浓度为3～8ng/ml，血浆蛋白的终浓度为40～60ng/ml；

所述B型培养基由以下组分组成：完全培养基、CD28抗体、白介素-2、维生素C、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；在B型培养基中，CD28抗体5～15ng/ml；在B型培养基中，白介素-2的终浓度为1800～2200u/ml，维生素B6的终浓度为5～15ng/ml，维生素C的终浓度为5～15ng/ml，L-谷氨酰胺的终浓度为80～120ng/ml,丙铜酸钠的终浓度为5～15ng/ml，血浆蛋白的终浓度为15～25ng/ml；

在所述第二次培养与第三次培养之间，和/或，在第三次培养之后，还包括加入C型培养基进行培养；C型培养基由以下组分组成：完全培养基、CD28抗体、白介素-2、维生素C、维生素B6、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；在C型培养基中，CD28抗体的终浓度为3～8ng/ml,白介素-2的终浓度为450～550u/ml，维生素B6的终浓度为3～8ng/ml，维生素C的终浓度为3～8ng/ml，L-谷氨酰胺的终浓度为40～60ng/ml,丙铜酸钠的终浓度为3～8ng/ml，血浆蛋白的终浓度为5～15ng/ml。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，待细胞增值启动并形成细胞团并且细胞密度达到2ⅹ10⁷～5ⅹ10⁷个/ml进行所述第二次培养；待细胞密度达到2ⅹ10⁷～5ⅹ10⁷个/ml时进行第三次培养。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述第一次培养的培养天数为3～6天，第二次培养的培养天数为10～12天。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，在所述第二次培养与第三次培养之间，当细胞密度达到2ⅹ10⁷～5ⅹ10⁷个/ml时，加入C型培养基，在第三次培养之后，当细胞密度达到2ⅹ10⁷～5ⅹ10⁷个/ml时，加入C型培养基。

5.一种T细胞的培养基组合，其特征在于，其包括有A抗培养基、K型培养基以及B型培养基，和/或C培养基；

所述A抗培养基由以下组成组成：完全培养基、CD3单抗、白介素-2、维生素B6、干扰素-γ、白介素-1b、白介素-4、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；在A抗培养基中，CD3单抗的终浓度为80～120ng/ml；白介素-2的终浓度为800～1200u/ml，维生素B6的终浓度为5～15ng/ml，干扰素-γ的终浓度为15～25ng/ml，白介素-1b的终浓度为5～15ng/ml，白介素-4的终浓度为5～1ng/ml，L-谷氨酰胺的终浓度为180～220ng/ml,丙铜酸钠的终浓度为15～25ng/ml，血浆蛋白的终浓度为40～60ng/ml；

所述K型培养基由以下组成组成：完全培养基、PD-1抗体、白介素-2、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；在K型培养基中，PD-1抗体的终浓度为5～15ng/ml；白介素-2的终浓度为1800～2200u/ml，L-谷氨酰胺的终浓度为40～60ng/ml,丙铜酸钠的终浓度为3～8ng/ml，血浆蛋白的终浓度为40～60ng/ml；

所述B型培养基由以下组成组成：完全培养基、CD28抗体、白介素-2、维生素C、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；在B型培养基中，CD28抗体5～15ng/ml；在B型培养基中，白介素-2的终浓度为1800～2200u/ml，维生素B6的终浓度为5～15ng/ml，维生素C的终浓度为5～15ng/ml，L-谷氨酰胺的终浓度为80～120ng/ml,丙铜酸钠的终浓度为5～15ng/ml，血浆蛋白的终浓度为15～25ng/ml；

C型培养基由以下组成组成：完全培养基、CD28抗体、白介素-2、维生素C、维生素B6、L-谷氨酰胺、丙铜酸钠以及血浆蛋白；在C型培养基中，CD28抗体的终浓度为3～8ng/ml,白介素-2的终浓度为450～550u/ml，维生素B6的终浓度为3～8ng/ml，维生素C的终浓度为3～8ng/ml，L-谷氨酰胺的终浓度为40～60ng/ml,丙铜酸钠的终浓度为3～8ng/ml，血浆蛋白的终浓度为5～15ng/ml。