[发明专利]一种基于聚合物点的光电和温度双信号响应的唾液酸生物传感器的制备与应用

权利要求书

1.一种基于聚合物点的光电和温度双信号响应的唾液酸生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在湿润的麂皮上依次用50纳米和30纳米的氧化铝粉末对玻碳电极（GCE）进行机械打磨抛光，直至电极表面光亮洁净，用去离子水冲洗电极表面残余的氧化铝粉末，最后用无水乙醇和二次去离子水进行彻底清洗；

（2） 滴加3μL浓度为3mg/mL的富勒烯（C₆₀）溶液至抛光干净的玻碳电极表面，放至红外灯箱内烘干后取出，室温下冷却，制得C₆₀修饰得玻碳电极；

（3）滴加3μL浓度为3mg/mL的金纳米（Au）溶液于步骤（2）所制得的电极表面，放至红外灯箱内烘干，冷却至室温，制得Au/C₆₀修饰的玻碳电极；

（4）滴加3μL浓度为5.0mM的巯基苯硼酸（MPBA）溶液至步骤（3）所制得的电极表面，室温下反应40min后用二次去离子水进行冲洗，除去电极表面的物理吸附，晾干备用，制得MBPA/Au/C₆₀修饰的玻碳电极；

（5） 滴加3μL不同浓度的唾液酸（SA）标准溶液至步骤（4）所获得的电极表面，于4°C冰箱中孵育40 min，反应完成后用二次去离子水冲洗除去多余的SA分子，晾干，得到SA/MBPA/Au/C₆₀修饰的玻碳电极，并保存在4°C冰箱中；

（6） 取3 μL 浓度为 1.0 wt.% 的BSA 滴加到步骤 ( 5) 所制得的修饰电极表面并在4°C冰箱中孵育40 min, 来封闭电极表面上非特异性活性位点，用去离子水冲洗电极表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中；

（7）最后滴加3μL浓度5mg/mL的聚合物点功能化的扇形金红型的二氧化钛标记的二抗溶液（R-TiO₂@TPP-Pdot @Ab₂）于步骤（6）所制得的电极表面，免疫识别40min后，用二次去离水冲洗；晾干，制得R-TiO₂@TPP-Pdot @Ab₂/SA/MBPA/Au/C₆₀修饰的玻碳电极为待测电极。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

（1）扇形金红石型的二氧化钛（R-TiO₂）由下述的方法制备：1g 十二烷基苯磺酸钠（SDBS）溶解于50 mL 2.2 mol/L HNO₃溶液，在漩涡混合器上振荡混匀数十分钟后加入1 mL钛酸异丙酯（TIP），然后在48 °C 的条件将上述的混合物下持续振荡24h，用去离子水和乙醇对反应后的混合物进行多次冲洗，经离心、60°C干燥处理后在400 °C下煅烧1h，以去除产物中残留的有机物成分，得到最终产物；将所得产物均匀分散在1 mL去离子水中（将所得R-TiO₂溶液放置在4°C冰箱中，储存备用；

（2）间四苯酚掺杂的聚合物点（TPP-pdot）由下述的方法制备：将聚合物（PFBT），功能聚合物共马来酸酐（PSMA）和增敏剂间四苯酚（TPP）分别溶解在四氢呋喃（THF）中，超声使其分散均匀，混合上述三种溶液，在混合液中，PFBT的浓度为200 µg/mL，PSMA的浓度为40 µg/mL，TPP的浓度为10 µg/mL；随后将获得的混合溶液超声20min，形成均匀分散的溶液；在水浴超声条件下，将4 mL的上述混合物迅速加入到20 mL的去离子水中，用氮气吹扫溶液中的THF溶剂分子，最后将混合物在55°C条件下旋转蒸发，来充分去除残余的THF分子，得到黄色透明的液体；

（3）聚合物点功能化的扇形金红石性二氧化钛标记的二抗溶液（R-TiO₂@TPP-Pdot @Ab₂）由下述方法制备：1）0.5 mL浓度为5 mg/mL的步骤（1）制得的R-TiO₂溶液和0.5 mL浓度为5 mg/mL的步骤（2）所制得的TPP-pdot在室温下混合振荡4h,离心洗涤数次得到R-TiO₂@TPP-Pdot复合物溶液，将其重新分散在二次去离水中；2）取体积比为2：1的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐 (NHS)的混合溶液50µL加入到200 µL的上述复合物溶液中，反应30min，聚合物点上的羧基被活化；3）200µL的唾液酸抗体加入到步骤2）中所得溶液中，利用酰胺键的作用，反应40min后得到被功能化的探针分子，离心洗涤数次后重新分散在pH等于7.4的磷酸缓冲溶液中，制得R-TiO₂@TPP-Pdot @Ab₂的探针溶液，放至4°C的冰箱冷藏备用。