[发明专利]一种细胞外囊泡的提取方法及试剂盒

说明书

本发明涉及生物分离提取技术领域，具体涉及一种细胞外囊泡的提取方法。所述方法包括：提供生物样本；在足以使生物样本中杂质部分或全部保留在捕获表面之上的条件下，使所述生物样本经过至少两次与所述捕获表面接触；其中，所述杂质为生物样本中除细胞外囊泡之外的部分或全部的其他物质，所述捕获表面包括球状颗粒多孔材料的内表面和/或外表面；在杂质部分或全部保留在捕获物表面之上时，流穿液即为提取到包含细胞外囊泡的液体；或进一步对上述流穿液进行浓缩。本发明能够快速对细胞外膜囊泡的进行分离纯化，并且该分离操作简单，单次使用成本低，分离样本纯度高，样本生物活性保持良好，应用在生物标志物发现、生物治疗等方面的基础研究与工业生产中。

技术领域

本发明涉及生物分离提取技术领域，具体涉及一种细胞外囊泡的提取方法及试剂盒。

背景技术

细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是通过进化保守的途径，由包括从原核生物到更高级的真核生物与植物细胞所释放的一类含膜的囊泡。过去的数十年，细胞外囊泡由于可以转运蛋白、脂类、核酸和糖类进而影响靶向与生成细胞的不同的生理与病理功能，从而被认为是原核与真核生物细胞间交流的重要载体。基于尺寸，细胞外囊泡可以分为小细胞外囊泡(<300nm,small EVs，sEVs)和中大细胞外囊泡>300nm(medium/large EVs，m/lEVs)

外泌体(exosomes)是细胞外囊泡的一个亚类，直径为30-150nm属于sEVs，外泌体密度为1.13-1.19g/mL，形成于细胞内的多囊泡体，通过多囊泡体膜与细胞膜融合而释放到细胞外。哺乳动物EVs广泛分布于各种体液中，包括脑脊液、鼻涕、唾液、支气管肺泡灌洗液、关节滑液、胆汁、血液、羊水、精液、尿液、子宫粘液和粪便。体液来源的EVs是来自于体液中的细胞和/或者体液腔内表面细胞的混合物，他们通过脂质膜包裹蛋白核酸等多种生物分子，使其免于体液中相应降解酶的酶解，从而成为生理病理信息来源或者实现细胞间信号的远距离传递。研究人员已发现哺乳动物细胞来源的EVs广泛参与生物系统动态平衡、疾病发展与进展，如神经突出交流和神经再生与退行性变，肿瘤生成和耐药。而sEVs天然的低免疫原性和高度的生物屏障通透性则赋予其成为药物载体的潜力。

外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)是一类主要源自于原核革兰氏阴性菌的细胞外囊泡，直径在30-300nm。OMVs通过细菌外膜(outer membrane)出芽生成而释放至细胞外，富集了LPS、核酸、脂质、外膜蛋白、周质蛋白、内膜蛋白与胞质蛋白等。一方面，OMVs所富集的分子提示其在治病过程中可能具有重要作用；另一方面，多项研究表明，OMVs有高度的免疫原性，可以在体内同时激活天然或者获得性免疫，具有成为有效疫苗的巨大潜力。

无论是用于生物学机制研究的EVs分子检测或者功能分析，还是用于生物标志物发现的核酸蛋白等生物分子检测，或者是用于小分子或者生物大分子的工具载体或者治疗载体的开发，足量生物活性保持良好的高纯度EVs都是最底层的需求。因此，EVs提取方法对EVs研究和应用开发领域都具有相当重要的影响。

目前外泌体的提取常用如下几种方式：

一是超速离心法，主要包括差速离心和密度梯度离心，这是目前EVs提取最常用的方法之一。差速离心法虽然操作简单，但操作费时(2-3hr)，分离产物纯度低，外泌体回收率较低，分离量放大受限，且需要配制昂贵的超速离心机；密度梯度离心则需要预先完成差速离心浓缩，虽然纯度高，但除去前述的缺点外，操作繁琐，更加费时(>16hr)。

二是多聚物沉淀法，该方法由多聚物(如PEG)与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中收集病毒。EVs分离操作简单，成本低廉，但一般需过夜操作，耗时较长，且最大的问题仍然是纯度低，有大量蛋白和核酸杂质被共沉淀。

三是超滤法，该方法操作简单，但外泌体受机械剪切力大，可能影响外泌体的生物活性和结构，且纯度更加不足，更多的是起到富集而不是纯化提取的作用。