[发明专利]一种循环肿瘤细胞分型定量检测卡及其制备方法和使用方法

说明书

本发明公开了一种循环肿瘤细胞分型定量检测卡及其制备方法和使用方法，包括底卡和面卡，所述底卡上设有：加样区，与加样区连接的多个结合区，通过时间阀与结合区一一对应连接的多个检测区；所述结合区及检测区的底部均并联有微通道；所述微通道连接时间阀；所述面卡上设有加样孔和观察孔，加样孔的位置与底卡加样区对应，观察孔的位置与底卡检测区对应。本发明通过微流控技术控制待测样品的流速和流量，具有同一种标志物的循环肿瘤细胞通过一条微通道进入检测区，避免相互干扰，从而减少误差，增加反应灵敏度；将待测样品制备成水包水微液滴，增大检测限度。

技术领域

本发明涉及微流控技术和免疫荧光微球免疫层析技术相结合的技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞分型定量检测卡及其制备方法和使用方法。

背景技术

多年来，癌症一直是威胁人类健康的主要杀手，我国虽是发展中国家，但疾病谱已经发生转变，癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一，我国已成为世界第一癌症大国。近年来我国每年新发病例约为160万，死亡高达130万，平均每死亡5个人中，就有一人死于癌症。而且，随着工业化、城镇化、环境污染、不良生活习惯与不合理生活方式的普遍存在，我国肿瘤发病率正以每年3％-5％的速度提高，尤其是肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌等。癌症不仅严重威胁着国民的生命与健康，而且给家庭、社会、国家造成了沉重的负担，是一个非常突出而又迫切需要解决的社会公共卫生难题。

癌症患者外周血液中极其微量的循环肿瘤细胞(CTCs)，被视作肿瘤诊断十分理想的生物标志物，对疾病的早期诊断、预测治疗反应以及疾病进展、开展个体化治疗等方面的研究和应用具有重要价值。但是，由于在1毫升血液中只存在几十个甚至几个循环肿瘤细胞，因此人们迫切需要开发出一种高效、可靠以及高通量的循环肿瘤细胞分离富集平台。

CTCs直接检测方法基于CTCs表面分子标记物的检测。CTCs标志物主要分两类：(1)上表皮细胞标志物，如1.上皮细胞角蛋白(CK)如CK7、CK8、CK18、CK19；2.上皮细胞膜特异性抗原如EMA、HMFG、HEA125；3.肿瘤相关糖蛋白如TAG12；(2)间质细胞标志物，如N-cadherin、SnaⅠ1、Survivin、Vimentin、Twist1等。第一类以哈佛大学的CTC-Chip芯片、强生公司的CellSearch全自动CTCs检测仪为代表，其中CellSearch系统是目前唯一被美国食品药品监督管理局批准用于CTCs临床检测的新技术，但是检测结果容易假阴性，检测灵敏度较差，漏检率较高的问题；其次，这类方法成本昂贵约4000元/次，一般患者较难承受相应的检测费用，目前已经退市。

微流控技术(Microfludics)是指在至少有一维为微米甚至纳米尺度的低维通道结构中控制体积为皮升至纳升的流体进行流动并传质、传热的技术。实现微流控操控的主要方法就是将流体限制在一个微米甚至纳米尺度的通道中，流体在微流控的微通道中具有独特的流体性质，如层流、液滴等等。当微通道在微米甚至纳米尺度时，微通道表面积与其内部体积比很大，通道的结构、形状和壁面性质都对流体的流动状态产生极大影响。因此，微流控可以实现一系列常规方法难以完成的微加工和微操作。

荧光微球是指将荧光团通过包埋、共价键连接等方式引入有机或无机纳米粒子中，并让纳米粒子承担有机小分子荧光染料的检测、标记等功能，具有相对稳定的形态结构以及发光行为。荧光微球免疫层析技术是继胶体金免疫层析技术后，在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，与胶体金免疫层析技术一样具有快速、操作简便等优点。

综上所述，目前CTCs的检测技术方法均有较大的缺陷，灵敏度较低，漏检率较高。因此，当前迫切需要研发一种高效、低成本的CTCs检测平台，能够检测血液标本中CTCs数量，从而为肿瘤的临床诊断、疗效监控和预后判断提供更准确的信息。

发明内容