[发明专利]一种快速检测基因编辑有效性的方法

说明书

本发明提供一种快速检测基因编辑有效性的方法，包括将gRNA转入载体中，再将该载体转入受体菌中，将所得的受体菌转入待检测植物的器官中，培育，然后提取所述器官上被处理部位的细胞基因组DNA，检测靶标基因的表达情况，实现对gRNA剪切效率的快速评估。本发明通过在马铃薯叶片中瞬时表达基因编辑的系统来检测其对靶标基因的剪切效率，涉及的DNA提取方法简单、高效、便宜，实现对靶标基因的成功敲除。

技术领域

本发明涉及基因编辑效率的检测技术领域，特别是涉及一种快速检测基因编辑有效性的方法。

背景技术

基因编辑技术使用一种切割细胞中特定DNA序列的核酸酶，针对动植物相关基因进行定点的精确编辑。而CRISPR-Cas9(cluster regularly interspaced shortpalindromic repeats,CRISPR)基因编辑技术由于它的简单性和低成本，是目前最受欢迎的基因编辑技术。在向导RNA的带领下，通过碱基互补配对可以靶向PAM(原间隔序列临近基序，protospacer adjacent motif)附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。而生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中靶标基因的敲除。这种技术已经在很多作物中得到应用，如水稻，番茄等。由于马铃薯是四倍体种，难以获得基因敲除的纯合体，该方法在马铃薯中的研究报道很少。即便是针对同一个基因进行编辑，不同的向导RNA效率也是不一样的，而有些向导RNA会出现没有效果的情况，目前对于出现这种情况还没有客观合理的解释。由于获得进行过基因编辑的作物的过程较长，所以一般在决定将哪个向导RNA转入作物体内前都会对向导RNA的效率进行检测。在拟南芥、水稻和番茄中检测向导RNA对于编辑靶标基因的效率一般用原生质体进行预实验，而马铃薯等植物的原生质体的获取和转化相对于其他作物来说要难很多，所以至今都还没有成功的针对基因编辑预实验的报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种快速检测基因编辑有效性的方法，用于快速检测植物基因编辑中针对靶标基因的向导RNA的剪切效率。

本发明提供一种快速检测基因编辑有效性的方法，包括：将gRNA转入中，再将该载体转入受体菌中，将所得的受体菌转入待检测植物的器官中，培育，然后提取所述器官上被处理部位的细胞基因组DNA，检测靶标基因的表达情况，实现对gRNA剪切效率的快速评估。

可选地，先在所述待检测植物的器官上制造伤口，然后将所述受体菌的菌液注入该伤口。

可选地，所述载体选自能用于CRISPR-CAS9表达的载体。

可选地，所述载体选自双元载体。

可选地，所述双元载体选自pCAMBIA1301、pCAMBIA1300中的至少一种。

可选地，所述受体菌选自农杆菌。

可选地，所述农杆菌选自菌株BLA4404、AGL1中的至少一种。

可选地，所述待检测植物处于生长期。

可选地，所述待检测植物可以是二倍体、四倍体或其他多倍体植物。

可选地，所述待检测植物选自马铃薯、甘薯、木薯、西红柿、黄瓜、拟南芥中的至少一种，其中，马铃薯具体可以为Desiree、大西洋等品种。

可选地，所述植物器官选自营养器官、生殖器官中的至少一种。

可选地，所述营养器官选自根、茎、叶中的至少一种。

可选地，所述生殖器官选自种子、花、果实中的至少一种。

例如，如果处理对象为马铃薯，则选择叶片进行受体菌的转入，如果是拟南芥，则可以选择花进行受体菌的转入。